薛恩興，張　雪，陳成旺，張　宇，張凌洲(溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，手術(shù)室，浙江溫州5000;溫州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院手外科，浙江溫州500)

瘦素通過JAK2/STAT3途徑調(diào)控椎間盤髓核細胞的分解代謝*

薛恩興1△，張雪2，陳成旺1，張宇1，張凌洲3
(溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院1關(guān)節(jié)外科，2手術(shù)室，浙江溫州325000;3溫州醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院手外科，浙江溫州325200)

［摘要］目的:探討瘦素對椎間盤髓核細胞中退行性變相關(guān)分解代謝基因的影響，并探討其機制。方法:培養(yǎng)SD大鼠髓核細胞，行cytokeratin 19和II型膠原免疫組化進行鑒定。使用瘦素和(或)白細胞介素1β(IL-1β)作用于髓核細胞，real-time PCR分析MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-4、ADAMTS-5、aggrecan和COL2A1的表達水平。阿利辛藍染色和免疫組化分析II型膠原和蛋白多糖的生成。Western blot分析激活的信號通路，并使用不同通路的抑制劑來分析信號通路的作用。結(jié)果: Real-time PCR顯示單用瘦素可以提高MMP-1、MMP-13、ADAMTS-4和ADAMTS-5的表達水平; IL-1β和瘦素可以協(xié)同提高MMP-1、MMP-3和ADAMTS-5的表達水平;瘦素降低髓核細胞II型膠原的表達，PI3K/Akt通路和JAK2/STAT3通路均被激活，但使用抑制劑后顯示只有JAK2/STAT3信號通路參與瘦素對髓核細胞的作用。結(jié)論:瘦素通過調(diào)節(jié)JAK2/STAT3信號通路促進髓核細胞的分解代謝，可能是肥胖與椎間盤退變相互關(guān)聯(lián)的機制。

［關(guān)鍵詞］髓核細胞;瘦素;白細胞介素1β;分解代謝

［修回日期］2015-07-15

椎間盤退變的致病因素較多，如異常的應力、外傷和遺傳因素等，但是最近肥胖逐漸被認為與椎間盤退變密切相關(guān)［1-2］。上述這些因素導致椎間盤合成代謝與分解代謝的失衡，引起細胞外基質(zhì)II型膠原和蛋白多糖的降解，以及I型膠原合成的增加，最終導致髓核組織纖維化和椎間盤結(jié)構(gòu)的改變［3-4］。細胞外基質(zhì)合成和分解的平衡主要是由基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)和含血小板應答蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs，ADAMTS)，以及相應的蛋白酶抑制因子進行調(diào)控。MMPs和ADAMTS降解細胞外的蛋白多糖和II型膠原，引起髓核的分解代謝。

瘦素(leptin)是由脂肪組織分泌的多肽類激素，與肥胖有密切的關(guān)系［2］。研究報道，瘦素可以調(diào)控能量平衡、免疫功能和骨的形成等［5-8］。Zhao等［9］和Gruber等［10］發(fā)現(xiàn)瘦素和其受體在髓核細胞和纖維環(huán)細胞中表達，并且瘦素可以促進軟骨細胞表達分解代謝酶和炎癥因子，因此瘦素被認為介導了肥胖與骨關(guān)節(jié)炎的聯(lián)系［11］，但是瘦素與髓核細胞分解代謝的關(guān)系尚未有明確的研究，而肥胖與椎間盤退變的機制也不清楚，因此本實驗通過瘦素作用于髓核細胞，觀察髓核細胞的分解代謝以及其中的機制，以闡明肥胖與椎間盤退變的相互關(guān)系。

材料和方法

1材料

信號通路抑制劑(Nottingham) ; IL-1β、選擇性PI3K抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)、重組大鼠瘦素和阿利辛藍(Sigma) ; DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和II型膠原酶(Gibco) ; RIPA細胞裂解液、BCA蛋白含量測定試劑、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒及ECL發(fā)光液(上海碧云天公司) ; p-Akt、Akt、p-STAT3、STAT3和GAPDH兔抗大鼠多克隆抗體(CST) ;羊抗兔辣根過氧化物酶IgG(北京康為世紀公司)。SD大鼠由溫州醫(yī)學院動物實驗室提供，許可證號為SCXK(浙) 2010-0044。

2方法

2.1髓核細胞培養(yǎng)和處理根據(jù)文獻報道［12］，30只雄性SD大鼠(3月大小，250～300 g)，使用10%的水合氯醛(3.5 mL/kg)麻醉后安樂死。取出L1～L5后，在顯微鏡下分離膠凍狀髓核組織。使用0.1% II膠原酶在37℃消化髓核組織4 h，再使用200目的濾網(wǎng)過濾細胞。髓核細胞培養(yǎng)在25 cm2的培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的高糖DMEM(1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)在5% CO2、37℃孵育箱中進行培養(yǎng)。當細胞融合到80%～90%的時候，使用0.25%含EDTA的胰酶進行消化傳代。本實驗所有的細胞均為第2代髓核細胞。

在進行處理之前，用2%的FBS的培養(yǎng)基孵育髓核細胞12 h，再加信號通路的抑制劑和IL-1β(10 μg/L)，30 min后再加或者不加瘦素。行real-time PCR時，髓核細胞由不同濃度的瘦素進行孵育(0.1、1或者10 mg/L)，或者由瘦素(10 mg/L)和IL-1β(10 μg/L)共同孵育，或者由瘦素(10 mg/L)和wortmannin(PI3K/Akt抑制劑20 nmol/L)或AG490(JAK2/STAT3 inhibitor 40 μmol/L)處理48 h。行阿利辛藍染色時，瘦素(10 mg/L)處理髓核細胞1周。行Western blot時，髓核由瘦素(10 mg/L)處理10 min或者60 min，或者由瘦素和相應的抑制劑共同處理60 min。

2.2免疫組化和免疫熒光在常溫下，24孔板中4%多聚甲醛固定髓核10 min，PBS洗3次，0.2% Triton X-100處理15 min。5%山羊血清封閉30 min后，II型膠原I抗(1∶100)和cytokeratin 19 I抗(1∶100)在4℃下孵育細胞過夜。行免疫組化時，孵育I抗后的細胞由辣根過氧化物酶標記的II抗在室溫下孵育2 h，蘇木素復染30 s。行免疫熒光時，孵育FITC標記的II抗室溫下2 h，再使用DAPI染核5 min。最終，這些細胞在熒光顯微鏡下或者光學顯微鏡下進行觀察。

2.3阿利辛藍染色阿利辛藍粉末溶解于3%冰醋酸溶液中形成1%濃度溶液，核固紅粉末溶解在5%硫酸鋁中形成0.1%濃度的溶液。4%多聚甲醛固定髓核細胞室溫下10 min，1%阿利辛藍溶液37℃下染色30 min。細胞水洗5 min，在0.1%核固紅溶液中復染20 min，在倒置顯微鏡下觀察染色的密度。

2.4Western blot實驗使用含有1% PMSF的RIPA裂解液提取髓核細胞的總蛋白?？偟鞍诐舛扔稍鰪娦偷腂CA蛋白試劑盒進行檢測。使用1.5 mm的玻璃板，上樣量為30 μL，每個樣品含有蛋白30 μg。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE)分離蛋白，濕法300 mA恒流轉(zhuǎn)移到聚偏(二)氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜上。5%脫脂牛奶封閉后，使用p-Akt、Akt、p-STAT3、STAT3和GAPDH抗體(均為1∶1 000) 4℃搖床上孵育過夜，洗滌3次后，使用相應的辣根過氧化物酶標記的II抗室溫下孵育2 h。滴加ECL發(fā)光液后在增強型化學發(fā)光檢測系統(tǒng)上(PerkinElmer)檢測，最后使用AlphaEaseFC 4.0軟件檢測條帶的光密度。

2.5Real-time PCR實驗TRIzol法提取髓核總的RNA，并測試RNA濃度和純度。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermantas)將1 μg RNA逆轉(zhuǎn)成cDNA。PCR擴增體系為20 μL，包含有10 μL 2×的SYBR Premix ExTaq mixture(TaKaRa)，0.2 μmol/L的引物，2 μL的2倍稀釋的cDNA和無菌蒸餾水。PCR擴增在real-PCR儀上進行(Roche)，所用引物如表1所示。得到的Ct值除以GAPDH的Ct值。用2－ΔΔCt方法計算不同組相對的mRNA表達水平。

表1　ADAMTSs、MMPs、Aggrecan、COL2A1和GAPDH的引物序列Table 1.The sequences of the primers for real-time PCR

3統(tǒng)計學處理

用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，采用單因素方差分析比較不同組別之間的差異，各組均數(shù)間的多重比較使用Tukey’s檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1髓核細胞的鑒定

為了保證髓核細胞的純度，僅選取膠凍狀凝膠樣的髓核組織，而放棄纖維環(huán)和終板。在相差顯微鏡下觀察，髓核細胞類似于軟骨細胞的形態(tài)，多邊形和星形，并在胞質(zhì)和細胞突起中含有氣泡。通過阿利辛藍染色和免疫組化檢測胞質(zhì)內(nèi)蛋白聚糖和II型膠原表達，發(fā)現(xiàn)II型膠原主要分布在細胞核周圍;此外，在熒光顯微鏡下，檢測髓核細胞的特異性標記蛋白cytokeratin 19，進一步證實細胞的純度，見圖1。

2瘦素調(diào)節(jié)髓核細胞金屬蛋白酶的表達水平

椎間盤中對髓核細胞外基質(zhì)進行降解的蛋白酶較多，而本實驗中研究的蛋白酶主要包括MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13、ADAMTS-4和ADAMTS-5。當作于髓核細胞的瘦素劑量增加時，MMP-1、MMP-13、ADAMTS-4和ADAMTS-5的mRNA表達水平也隨之明顯增加(P＜0.05)。與對照組相比，瘦素組的MMP-1和MMP-13的mRNA表達水平增加8倍。雖然單獨瘦素作用下，MMP-3和MMP-9的mRNA表達水平?jīng)]有改變，但在瘦素(10 mg/L)和IL-1β協(xié)同作用時MMP-3的mRNA表達水平增加，提示炎癥的基礎水平是調(diào)控的重要因素。此外，在瘦素和10 μg/L 的IL-1β作用下，MMP-1和ADAMTS-5的水平也升高，見圖2。

Figure 1.Identification of NP cells.A: under phase-contrast microscope; B: Alcian blue staining; C: immunocytochemistry for collagen II; D: immunofluorescence for cytokeratin 19.圖1髓核細胞的鑒定

Figure 2.The effect of leptin and/or IL-1β on the catabolic enzymes in the NP cells.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control;#P＜0.05 vs IL-1β.圖2瘦素和(或) IL-1β對髓核細胞分解代謝酶的作用

3瘦素減少COL2A1 mRNA和II型膠原蛋白的表達

因為細胞外基質(zhì)的合成和降解是由金屬蛋白酶調(diào)節(jié)，因此我們觀察了瘦素對細胞外基質(zhì)的調(diào)節(jié)作用，特別是蛋白多糖和II型膠原的含量。用阿利辛藍染色方法檢測蛋白聚糖的含量，對照組與瘦素組(細胞經(jīng)瘦素10 mg/L處理1周)無明顯差異。相比之下，用免疫組化細胞化學分析方法檢測II型膠原的水平，瘦素組的細胞與對照組相比，II型膠原的表達水平明顯降低。Aggrecan的real-time PCR的結(jié)果與阿利辛藍染色結(jié)果一致，表明10 mg/L的瘦素對48 h后aggrecan的mRNA表達水平無影響，但是，瘦素組的COL2A1的mRNA表達水平明顯降低(P＜0.05)。細胞與瘦素和IL-1β共培養(yǎng)后，未明顯影響細胞外基質(zhì)的表達，見圖3。

4瘦素激活PI3K/Akt和JAK2/STAT3通路

為了探索瘦素對髓核細胞中金屬蛋白酶的調(diào)控機制，通過Western blot分析PI3K/Akt和JAK2/STAT3信號通路的表達水平。用10 mg/L瘦素刺激髓核細胞10 min后觀察到Akt磷酸化水平明顯升高，瘦素誘導60 min后觀察，STAT3的磷酸化隨著髓核細胞的作用時間的增加而增加。使用PI3K/Akt和JAK2/STAT3信號通路抑制劑(分別是wortmannin 20 nmol/L和AG490 40 μmol/L)可明顯抑制瘦素作用下這些信號通路的激活。如圖4所示，當信號通路的抑制劑與瘦素共同作用于細胞時，Akt與STAT3的磷酸化水平明顯下降。

Figure 3.The effect of leptin on the proteoglycan and collagen II expression at both mRNA and protein levels.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control.圖3瘦素對髓核細胞蛋白多糖和II型膠原mRNA和蛋白表達水平的影響

5信號通路抑制劑對金屬蛋白酶表達的影響

為了進一步分析參與瘦素調(diào)節(jié)金屬蛋白酶的信號通路，單獨瘦素或者瘦素與信號通路抑制劑(wortmannin和AG490)干預髓核細胞后，通過real-time PCR測定金屬蛋白酶mRNA水平。JAK2/STAT3信號通路抑制劑(40 μmol/L AG490)逆轉(zhuǎn)瘦素誘導的MMP-1水平的升高(P＜0.05)。相反，PI3K/Akt抑制劑(20 nmol/L wortmannin)對MMP-1的表達沒有影響。相似的，AG490可以明顯抑制瘦素誘導的MMP-13 mRNA的表達(P＜0.05)。PI3K/Akt抑制劑不能抑制MMP-1和MMP-13，提示PI3K/Akt信號通路可能不參與瘦素調(diào)節(jié)的金屬蛋白酶表達，見圖5。

討論

近來，肥胖在椎間盤退變中的作用引起了廣泛的關(guān)注。前期的研究顯示肥胖是椎間盤退變引起的腰背痛的主要因素之一［13-14］。與沒有椎間盤退變的人群相比，有椎間盤退變的中國南方患者中體重指數(shù)(body mass index，BMI)顯著升高。根據(jù)磁共振顯示影像，Takatalo等［15］發(fā)現(xiàn)一些肥胖相關(guān)指標如腹圍、矢狀徑和腰部的周長與椎間盤退變密切相關(guān)。

肥胖引起椎間盤退變的潛在機制包括機械應力、動脈粥樣硬化等，但是脂肪因子，特別是瘦素在椎間盤退變中的作用仍然需要進一步研究。瘦素可以刺激椎間盤髓核和纖維環(huán)細胞的增殖，從而形成細胞簇［9-10］，而細胞簇是椎間盤退變的特征之一。更有報道發(fā)現(xiàn)瘦素還可以刺激髓核細胞的細胞骨架發(fā)生改變［16］。在本研究中，單獨的瘦素刺激可以促進MMP-1、MMP-13、ADAMTS-4和ADAMTS-5的mRNA水平的升高，而降低髓核細胞中II型膠原和蛋白的合成，這些均提示瘦素是促進椎間盤分解代謝的作用。因為瘦素和肥胖的關(guān)系，我們的研究提示瘦素可能部分介導肥胖導致的椎間盤退變。

在椎間盤退變的時候，細胞外基質(zhì)中金屬蛋白酶水平升高明顯，主要包括MMP-1、3、7、9、和13，以及ADAMTS-1、4、5、9和15［17］。Le等［18］發(fā)現(xiàn)MMP-1 和MMP-13在退變椎間盤中顯著表達，這或許可以解釋為什么瘦素引起MMP-1和13的升高，而不是MMP-3和MMP-9。MMP-13的主要目標是II型膠原，因此瘦素促進了MMP-13的升高而抑制了COL2A1的mRNA水平。相似的，Hui等［11］也發(fā)現(xiàn)瘦素可以導致關(guān)節(jié)軟骨膠原的釋放。與II型膠原不同的是，瘦素對蛋白多糖和aggrecan的影響不大，這可能是因為降解蛋白多糖的MMP-3 mRNA的改變不大。

瘦素與促炎介質(zhì)之間的關(guān)系非常復雜。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)瘦素可以協(xié)同IL-1β促進MMP-1、MMP-3和ADAMTS-5的升高，這提示瘦素使得髓核細胞對IL-1β的促炎作用更加敏感。但是在對膠原和蛋白多糖的作用中，并沒有看到協(xié)同作用。

Figure 4.Different signaling pathways regulated by leptin and relevant pharmacological inhibitors.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control;#P＜0.05 vs leptin.圖4瘦素對髓核細胞中PI3K/Akt和JAK2/STAT3信號通路的影響

Figure 5.The effect of different pathway inhibitors on the mRNA levels of MMP-1 and MMP-13 in the NP cells.Mean ±SD.n=6.＊＊P＜0.01 vs control.圖5不同信號通路抑制劑對瘦素作用下MMP-1和MMP-13表達水平的影響

研究報道，瘦素可以通過調(diào)控多條信號通路來發(fā)揮其生物學作用。JAK2、PI3K、MEK-1和p38激酶均被報道參與到瘦素在軟骨細胞中的促炎作用［19］。在神經(jīng)膠質(zhì)細胞中，IRS-1/PI3K/Akt/NF-κB 和p300信號通路參與到瘦素引起的IL-6的水平升高［20］。在軟骨細胞中，瘦素誘導的MMP-1、MMP-3 和MMP-13升高與STAT、MAPK、NF-κB和Akt信號通路的激活相關(guān)［11］。在本實驗中，瘦素可以激活髓核細胞中的Akt和JAK2/STAT3信號通路，但是當使用相應的抑制劑后，我們發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號通路并不參與瘦素引起的金屬蛋白酶的升高，因此可能只有JAK2/STAT3信號通路參與了leptin對髓核細胞的影響，而其它的信號通路還有待進一步研究。瘦素往往首先作用于細胞表面的瘦素受體，引起JAK2/STAT3信號通路上的關(guān)鍵分子STAT3發(fā)生磷酸化，文獻報道磷酸化后的STAT3發(fā)生聚化并轉(zhuǎn)移到細胞核中，從而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用，調(diào)節(jié)特定基因的轉(zhuǎn)錄水平［21］。而本文中，STAT3可能促進了MMP-1、MMP-13、ADAMTS-4和ADAMTS-5轉(zhuǎn)錄水平的升高，引起相應mRNA水平的上升，導致上述金屬蛋白酶的翻譯和表達的升高，這些需要將來的研究進一步地證實。

總之，本實驗發(fā)現(xiàn)單獨的瘦素，或者與IL-1β協(xié)同促進髓核細胞中MMP-1、MMP-9、MMP-3、ADAMTS-4和ADAMTS-5的mRNA水平升高。而COL2A1的mRNA和II型膠原的合成則被瘦素抑制。雖然瘦素可以激活PI3K/Akt和JAK2/STAT3信號通路，但是只有JAK2/STAT3信號通路參與到瘦素引起的金屬蛋白酶的升高。

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(責任編輯:林白霜，羅森)

Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3 pathways mediate effect of leptin on expression of catabolic genes in rat nucleus pulposus cells

XUE En-xing1，ZHANG Xue2，CHEN Cheng-wang1，ZHANG Yu1，ZHANG Ling-zhou3
(1Department of Joint Surgery，2Operating Room，Second Affiliated Hospital，Wenzhou Medical University，Wenzhou 325000，China;3Department of Hand Surgery，Third Affiliated Hospital，Wenzhou Medical University，Wenzhou 325200，China.E-mail: xueenxing@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To explore the effect of leptin on the expression of degeneration-related genes in rat nucleus pulposus (NP) cells and to detect the possible mechanism.METHODS: The normal NP cells isolated from SD rats were analyzed by immunochemistry and immunofluorescence for the collagen II and cytokeratin 19 expression.The NP cells were treated with leptin and/or interleukin-1β(IL-β).The mRNA expression of MMP-1，MMP-3，MMP-9，MMP-13，ADAMTS-4，ADAMTS-5，aggrecan and COL2A1 in the cells was detected by real-time PCR.Alcian blue staining and immunochemistry were used to examine the expression of proteoglycan and collagen II.Activation of involved pathways was studied by Western blot.The inhibitors of the pathways were used to reveal the effect of these pathways on NP cells.RESULTS: The results of real-time PCR revealed that leptin alone up-regulated the mRNA expression of MMP-1，MMP-13，ADAMTS-4，ADAMTS-5 and COL2A1.The synergy of leptin and IL-β was found in the increased expression of MMP-1，MMP-3 and ADAMTS-5.The NP cells treated with leptin showed less expression of collagen II.Both PI3K/Akt and JAK2/SATA3 pathways were activated by leptin，whereas only inhibitor of JAK2/SATA3 pathway reversed the expression of MMP-1 and MMP-13.CONCLUSION: Leptin may promote catabolism in rat NP cells via JAK2/SATA3 pathways，which may be the mechanism mediating the association between obesity and intervertebral disc degeneration.

［KEY WORDS］Nucleus pulposus; Leptin; Interleukin-1β; Catabolism

通訊作者△Tel: 0577-88002808; E-mail: xueenxing@163.com

*［基金項目］溫州市科技局項目(No.Y20140582)

［收稿日期］2015-03-26

［文章編號］1000-4718(2015)09-1673-07

［中圖分類號］R363

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.026