李彬彬，萬　鄭，孔　霞，廖　丹，王籽又，黃國良△(廣東醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東東莞53808)

表沒食子兒茶素沒食子酸酯通過調(diào)控P53/miR-34a抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖*

李彬彬1，2，萬鄭2，孔霞1，廖丹1，王籽又1，黃國良2△
(廣東醫(yī)學(xué)院1病理生理學(xué)教研室，2廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東東莞523808)

［摘要］目的:觀察表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)對鼻咽癌細(xì)胞增殖的影響，并以微小RNA-34a (miR-34a)為靶點(diǎn)探討其作用機(jī)制。方法:不同濃度的EGCG處理CNE-2Z細(xì)胞，CCK-8法、EdU染色法和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力的改變;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布的改變; Western blot檢測P53和Notch1蛋白水平的變化; real-time PCR檢測miR-34a和Notch1 mRNA的表達(dá)。結(jié)果: EGCG處理后，CNE-2Z細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，克隆形成能力降低，細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，呈劑量依賴關(guān)系;隨著EGCG濃度增高，P53和miR-34a的表達(dá)水平明顯上調(diào)，而其下游Notch1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平則明顯下降。結(jié)論: EGCG可能通過調(diào)控P53/miR-34a/Notch1通路誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖。

［關(guān)鍵詞］表沒食子兒茶素沒食子酸酯;鼻咽癌; P53;微小RNA-34a; Notch1

［修回日期］2015-05-21

△通迅作者Tel: 0769-22896402; E-mail: 44775879@qq.com

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是高發(fā)于我國南方地區(qū)和東南亞國家的惡性腫瘤之一。該腫瘤原發(fā)部位隱蔽，不易早期發(fā)現(xiàn)，惡性程度較高，易呈浸潤性生長及早期轉(zhuǎn)移。放射治療是鼻咽癌的主要治療手段，但單一放療手段治療中晚期鼻咽癌病例，5～10年生存率僅有40%左右。因此，尋找有效低毒的天然藥物或綜合治療方案，并探討其作用機(jī)制，對于提高鼻咽癌的臨床療效及預(yù)后，改善患者生活質(zhì)量有著重要意義。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯［(－) -epigallocatechin-3-gallate，EGCG］是綠茶中含量最高和最具有藥用功效的活性成分。近年來，EGCG在腫瘤預(yù)防及抗腫瘤活性上展現(xiàn)了很好的前景。體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)等均發(fā)現(xiàn)EGCG對肺癌、宮頸癌、胃癌、結(jié)腸癌、肝癌和鼻咽癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有抑制作用。Ruan等［1］對我國廣東省兩千多名個(gè)體進(jìn)行病例對照研究，發(fā)現(xiàn)喝茶與較低的鼻咽癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。近年來研究顯示，多種微小RNA(microRNA，miRNA)發(fā)揮腫瘤抑制因子或致癌因子的作用，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、黏附和血管生成等多個(gè)生物學(xué)過程，有望成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)［2］。本研究旨在觀察EGCG對鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2Z增殖和細(xì)胞周期的影響，并以miRNA-34a為靶點(diǎn)，探討其作用機(jī)制。

材料和方法

1主要試劑

EGCG購自Sigma，由PBS配成1 g/L，－20℃避光保存; CCK-8試劑盒購自Dojindo; EdU試劑盒購自廣州銳博生物科技公司; TRIzol試劑購自Invitrogen; real-time PCR相關(guān)試劑購自Promega; FS Universal SYBR Green Master購自Roche;兔抗人P53多抗購自Cell Signaling;兔抗人Notch1多抗和鼠抗人β-actin單抗購自Santa Cruz;紅外標(biāo)記羊抗兔和羊抗鼠Ⅱ抗購自Rockland。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)人低分化鼻咽癌細(xì)胞株CNE-2Z為本實(shí)驗(yàn)室保存，采用RPMI-1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，1×105U/L青霉素，100 mg/L鏈霉素)在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2CCK-8法檢測細(xì)胞活性取對數(shù)生長期CNE-2Z細(xì)胞，以3 000 cells/well接種到96孔板，培養(yǎng)24 h后換含不同濃度(10和20 μmol/L) EGCG的RPMI-1640培養(yǎng)基(含2%胎牛血清)處理，每組設(shè)5個(gè)平行孔;分別于24 h、48 h和72 h在每孔加入CCK-8工作液100 μL(含10 μL CCK-8溶液)，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，在多功能酶標(biāo)儀上測定450 nm波長各孔光吸收值(A值)，計(jì)算細(xì)胞抑制率。細(xì)胞抑制率(%)=(對照組A值－實(shí)驗(yàn)組A值)/對照組A值×100%。

2.3EdU摻入法檢測細(xì)胞增殖取對數(shù)生長期CNE-2Z細(xì)胞，以3 000 cells/well接種到96孔板，培養(yǎng)24 h后換含不同濃度(10和20 μmol/L) EGCG的RPMI-1640培養(yǎng)基(含2%胎牛血清)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每組設(shè)3個(gè)平行孔;加入終質(zhì)量濃度為50 μmol/L的EdU，繼續(xù)培養(yǎng)2 h;加入4%多聚甲醛固定30 min，0.5% Triton X-100室溫孵育20 min;加入1×Apollo反應(yīng)液100 μL避光孵育30 min，再加入5 mg/L Hoechst 33342避光孵育30 min; PBS清洗后，熒光顯微鏡下采集圖像。藍(lán)色為細(xì)胞核，紅色為EdU標(biāo)記處于增殖期的細(xì)胞，細(xì)胞增殖率=增殖細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

2.4平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆形成能力取對數(shù)生長期CNE-2Z細(xì)胞，以400 cells/well接種到6孔板，培養(yǎng)24 h后給予不同濃度(5和10 μmol/L) EGCG處理，每組設(shè)3個(gè)平行孔，連續(xù)培養(yǎng)約2周;用PBS清洗細(xì)胞2次，甲醇固定15 min后，0.4%結(jié)晶紫染色15 min，流水沖洗;將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，直接計(jì)數(shù)克隆數(shù)。

2.5流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布取對數(shù)生長期CNE-2Z細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞長至60%～70%滿度后換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞周期同步化;再給予不同濃度(10和20 μmol/L) EGCG處理24 h，每組設(shè)3個(gè)平行孔;收集細(xì)胞，加入預(yù)冷的70%乙醇固定，4℃過夜;離心后加入終濃度為100 mg/L RNase和100 mg/L PI染色液400 μL，混勻，室溫避光染色30 min;采用BD FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測分析。

2.6Western blot檢測P53和Notch1的蛋白表達(dá)不同濃度的EGCG(10和20 μmol/L)處理CNE-2Z細(xì)胞24 h后，加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白;采用BCA法測定蛋白濃度后加入等量蛋白樣品進(jìn)行10% SDS-PAGE凝膠電泳，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h;加入I抗［P53抗體和Notch1抗體(1∶500)］，4℃孵育過夜;加入紅外標(biāo)記的II抗(1∶10 000)，室溫孵育2 h; Odyssey近紅外雙色激光成像系統(tǒng)掃描成像，Quantity One軟件進(jìn)行條帶灰度分析。以β-actin作為內(nèi)參照。

2.7Real-time PCR檢測miR-34a和Notch1 mRNA表達(dá)不同濃度的EGCG(10和20 μmol/L)處理CNE-2Z細(xì)胞24 h后，TRIzol提取總RNA。采用帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的miR-34a特異性逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA;以cDNA為模板，采用SYBR GreenⅠ嵌合熒光法在ABI 7500實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，以U6 RNA作為內(nèi)參照;引物購自廣州銳博生物科技有限公司。采用Oligo(dT)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA;以cDNA為模板，real-time PCR反應(yīng)檢測Notch1 mRNA表達(dá)的上游引物為5’-GTCAACGCCGTAGATGACCT-3’，下游引物為5’-TCTCCTCCCTGTTGTTCTGC-3’，以GAPDH作為內(nèi)參照;引物由上海生工生物工程有限公司合成。所有標(biāo)本均重復(fù)3次，計(jì)算出Ct值，采用2－ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算分析。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0及GraphPad Prism統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理和分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 CCK-8法檢測EGCG對CNE-2Z細(xì)胞活性的影響

在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，給予不同濃度的EGCG(5、10、20、40和80μmol/L)作用CNE-2Z細(xì)胞24 h，CCK-8結(jié)果顯示，隨著濃度的增加，EGCG對CNE-2Z細(xì)胞活性的抑制作用逐漸增強(qiáng)，其IC50為33.82 μmol/L。在此基礎(chǔ)上，采用10 μmol/L和20 μmol/L EGCG作用CNE-2Z細(xì)胞不同時(shí)間(24 h、48 h和72 h)，結(jié)果如圖1所示，隨藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長，細(xì)胞活性的抑制率逐漸增加，具有明顯的劑量和時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。

Figure 1.The effect of EGCG on the viability in CNE-2Z cells detected by CCK-8 assay.Mean±SD.n=3.圖1 EGCG對CNE-2Z細(xì)胞活性的影響

2 EdU摻入法檢測EGCG對CNE-2Z細(xì)胞增殖的影響

與對照組相比，EGCG處理24 h組中EdU陽性的細(xì)胞明顯減少，且呈劑量依賴關(guān)系，提示EGCG可以減少處于增殖期的細(xì)胞，具有抑制CNE-2Z細(xì)胞增殖的作用，見圖2。

3 EGCG對CNE-2Z細(xì)胞克隆形成能力的影響

與對照組相比，5 μmol/L EGCG即可明顯抑制CNE-2Z細(xì)胞的克隆形成能力，其克隆形成數(shù)目和克隆形成大小均減少(P＜0.05)。隨著EGCG濃度的增加，其抑制作用更加明顯，見圖3。

4 EGCG對CNE-2Z細(xì)胞周期的影響

圖4所示，與對照組相比，EGCG能誘導(dǎo)G0/G1期細(xì)胞的百分率增加，而S期細(xì)胞的百分率減少，呈劑量依賴性，提示EGCG能將CNE-2Z細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。

5 EGCG對CNE-2Z細(xì)胞P53表達(dá)的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，隨著濃度的增加，EGCG能明顯提高P53蛋白的表達(dá)水平，呈劑量依賴關(guān)系，見圖5。

6 EGCG對CNE-2Z細(xì)胞miR-34a表達(dá)的影響

Real-time PCR結(jié)果顯示，EGCG能明顯上調(diào)miR-34a的表達(dá)，并具有濃度依賴性，見圖6。

7 EGCG對CNE-2Z細(xì)胞Notch1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

Real-time PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組相比，EGCG能明顯抑制Notch1的mRNA和蛋白表達(dá)，呈劑量依賴性，見圖7。

Figure 2.The results of EdU assay showed that EGCG inhibited the proliferation of CNE-2Z cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs 0 μmol/L.圖2 EGCG對CNE-2Z細(xì)胞增殖的抑制作用

Figure 3.EGCG suppressed colony formation of CNE-2Z cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs 0 μmol/L.圖3 EGCG抑制CNE-2Z細(xì)胞的克隆形成能力

討論

綠茶為中華民族的傳統(tǒng)保健飲料，幾乎無毒副作用，其水溶性提取物含有多種多酚類化合物，其中EGCG的含量最高，也最具有藥用功效。大量研究顯示［3］，EGCG可通過抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝中關(guān)鍵酶活性、抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移以及調(diào)節(jié)腫瘤血管形成等多種機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用。EGCG也發(fā)現(xiàn)能夠提高機(jī)體免疫功能及增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對放療的敏感性［4］。本研究應(yīng)用不同濃度的EGCG處理鼻咽癌細(xì)胞CNE-2Z后，CCK-8法檢測顯示細(xì)胞生長受到明顯抑制，呈現(xiàn)劑量和時(shí)間效應(yīng)關(guān)系; EdU摻入法檢測顯示隨著EGCG濃度的增加，EdU標(biāo)記細(xì)胞的比例逐漸減少，表明EGCG具有抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖的作用。此外，EGCG亦能明顯地降低CNE-2Z細(xì)胞的克隆形成能力。流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，EGCG能將CNE-2Z細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，不能進(jìn)入S期，這可能是EGCG抑制鼻咽癌細(xì)胞增殖的重要機(jī)制。

Figure 4.The effect of EGCG on the cell cycle distributions in CNE-2Z cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control group.圖4 EGCG對CNE-2Z細(xì)胞周期分布的影響

miRNA是真核生物體內(nèi)一類具有調(diào)控功能的非編碼RNA，長約19～25個(gè)核苷酸，在胞質(zhì)中通過堿基互補(bǔ)配對結(jié)合到下游靶基因mRNA的3’UTR區(qū)域，抑制mRNA的翻譯甚至促使其降解，進(jìn)而調(diào)控靶基因的表達(dá)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，miRNA表達(dá)或調(diào)控異常與人類多種腫瘤相關(guān)。miRNA參與調(diào)控重要腫瘤相關(guān)基因，發(fā)揮腫瘤抑制基因或者癌基因的功能，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。miR-34a是miR-34家族的成員之一，其基因位于人染色體的1p36.23，這一位點(diǎn)常伴隨多個(gè)基因的缺失或突變，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。目前多數(shù)研究認(rèn)為miR-34a在多種腫瘤中承擔(dān)抑制因子的作用，外源性表達(dá)miR-34a可通過調(diào)控細(xì)胞周期阻滯、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移等降低腫瘤細(xì)胞的惡性程度［5-6］。在神經(jīng)母細(xì)胞瘤、前列腺癌、胃癌及非小細(xì)胞肺癌等中均發(fā)現(xiàn)有miR-34a的低表達(dá)或表達(dá)缺失，參與腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展過程［5，7］。p53作為最重要的抑癌基因，它的突變和缺失在多種腫瘤包括鼻咽癌中是一個(gè)最為常見的生物學(xué)事件。體內(nèi)和體外的實(shí)驗(yàn)均表明，miR-34a是p53直接轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)，在腫瘤應(yīng)激和DNA損傷的情況下，miR-34a通過p53依賴的方式誘導(dǎo)表達(dá)［8］。在多種腫瘤如慢性淋巴細(xì)胞白血病、前列腺癌及胃癌等中，均發(fā)現(xiàn)p53的缺失或突變伴隨有miR-34a表達(dá)水平的下調(diào)［9-10］。在前期工作中，我們采用Agilent公司的Human miRNA V16.0芯片，檢測EGCG對CNE-2 Z細(xì)胞中miRNA表達(dá)譜的影響，發(fā)現(xiàn)miR-34a表達(dá)是明顯上調(diào)的。采用實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證也顯示，EGCG可上調(diào)CNE-2Z細(xì)胞中miR-34a的表達(dá)，呈劑量依賴性。同時(shí)，本研究也發(fā)現(xiàn)，隨著EGCG濃度增加，P53蛋白的表達(dá)也明顯增高，這可能與EGCG調(diào)控P53蛋白穩(wěn)定性增強(qiáng)進(jìn)而上調(diào)P53表達(dá)有關(guān)［11］。這些結(jié)果提示，EGCG可能通過促進(jìn)P53/miR-34a表達(dá)調(diào)控鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞G1期阻滯，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但其確切的交互關(guān)系尚需進(jìn)一步研究闡明。

Notch1是Notch基因編碼的蛋白家族成員之一，它是一種跨膜受體蛋白，通過與相應(yīng)的配體結(jié)合在多種細(xì)胞分化發(fā)育中起重要的調(diào)控作用［12］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Notch1信號傳導(dǎo)異常與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在一些腫瘤中如膠質(zhì)瘤、胰腺癌和結(jié)直腸癌中，Notch1被認(rèn)為作為癌基因起作用，通過影響細(xì)胞周期相關(guān)蛋白如cyclin D1、cyclin E、CDK2、p27等參與細(xì)胞周期調(diào)控，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖［13-14］。通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-34a與Notch1 的3'UTR高度同源配對，螢光素酶實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了miR-34a對Notch1基因的直接調(diào)控作用［15］。我們應(yīng)用不同濃度的EGCG處理鼻咽癌CNE-2Z細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，Notch1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均是明顯下降的，呈劑量依賴關(guān)系，這就提示EGCG可能通過降低Notch1表達(dá)抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖，而其作用機(jī)制可能與EGCG上調(diào)P53/miR-34a有關(guān)。但亦有研究顯示Notch1與P53之間存在直接相互關(guān)系，Notch1通過影響P53蛋白穩(wěn)定性進(jìn)而抑制P53介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡反應(yīng)［16］。

Figure 5.The effect of EGCG on the expression of P53 in the CNE-2Z cells by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs 0 μmol/L.圖5 EGCG對CNE-2Z細(xì)胞P53表達(dá)的影響

Figure 6.The effect of EGCG on the expression of miR-34a in the CNE-2Z cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs 0 μmol/L.圖6 EGCG對CNE-2Z細(xì)胞miR-34a表達(dá)的影響

Figure 7.The effect of EGCG on the expression of Notch1 atmRNA and protein levels in the CNE-2Z cells.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs 0 μmol/L.圖7 EGCG對CNE-2Z細(xì)胞Notch1 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

綜上所述，EGCG可能通過調(diào)控P53/miR-34a/Notch1通路誘導(dǎo)鼻咽癌細(xì)胞周期阻滯，抑制細(xì)胞增殖，將為EGCG在鼻咽癌防治中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

［參考文獻(xiàn)］

［1］Ruan HL，Xu FH，Liu WS，et al.Alcohol and tea consumption in relation to the risk of nasopharyngeal carcinoma in Guangdong，China［J］.Front Med China，2010，4 (4) : 448-456.

［2］Farazi TA，Spitzer JI，Morozov P，et al.miRNAs in human cancer［J］.J Pathol，2011，223(2) : 102-115.

［3］Singh BN，Shankar S，Srivastava RK.Green tea catechin，epigallocatechin-3-gallate (EGCG) : mechanisms，perspectives and clinical applications［J］.Biochem Pharmacol，2011，82(12) : 1807-1821.

［4］Lecumberri E，Dupertuis YM，Miralbell R，et al.Green tea polyphenol epigallocatechin-3-gallate (EGCG) as adjuvant in cancer therapy［J］.Clin Nutr，2013，32(6) : 894-903.

［5］Chen WY，Stallings RL.MicroRNA-34a functions as a potential tumor suppressor by inducing apoptosis in neuroblastoma cells［J］.Oncogene，2007，26 (34) : 5017-5022.

［6］Li L.Regulatory mechanisms and clinical perspectives of miR-34a in cancer［J］.J Cancer Res Ther，2014，10(4) : 805-810.

［7］Shi Y，Liu C，Liu X，et al.The microRNA miR-34a inhibits non-small cell lung cancer (NSCLC) growth and the CD44histem-like NSCLC cells［J］.PLoS One，2014，9 (3) : e90022.

［8］He L，He X，Lim LP，et al.A microRNA component of the p53 tumour suppressor network［J］.Nature，2007，447(7148) : 1130-1134.

［9］Ji Q，Hao XB，Meng Y，et al.Restoration of tumor miR-34 inhibits human p53-mutant gastric cancer tumorspheres ［J］.BMC Cancer，2008，8: 266.

［10］Dijkstral MK，van Loml K，Tielemans D，et a1.17p13/TP53 deletion in B-GLL patients is associated with microRNA-34a downregulation［J］.Leukemia，2009，231 (3) : 625-627.

［11］Jin L，Li C，Xu Y，et a1.Epigallocatechin gallate promotes p53 accumulation and activity via the inhibition of MDM2-mediated p53 ubiquitination in human lung cancer cells［J］.Oncol Rep，2013，29(5) : 1983-1990.

［12］Lai EC.Notch signaling: control of cell communication and cell fate［J］.Development，2004，131(5) : 965-973.

［13］Zhang XP，Zheng G，Zou L，et al.Notch activation promotes cell proliferation and the formation of neural stem cell-like colonies in human glioma cell［J］.Mol Cell Biochem，2008，307(1-2) : 101-108.

［14］Gopalakrishnan N，Saravanakumar M，Madankumar P，et al.Colocalization of β-catenin with Notch intracellular domain in colon cancer: a possible role of Notch1 signaling in activation of CyclinD1-mediated cell proliferation［J］.Mol Cell Biochem，2014，396(1-2) : 281-293.

［15］Li Y，Guessous F，Zhang Y，et al.MicroRNA-34a inhibits glioblastoma growth by targeting multiple oncogenes ［J］.Cancer Res，2009，69(19) : 7569-7576.

［16］Licciulli S，Avila JL，Hanlon L，et al.Notch1 is required for Kras-induced lung adenocarcinoma and controls tumor cell survival via p53［J］.Cancer Res，2013，73(19) : 5974-5984.

(責(zé)任編輯:林白霜，羅森)

Inhibitory role of epigallocatechin-3-gallate in proliferation of human nasopharyngeal carcinoma cells by targeting P53/miR-34a

LI Bin-bin1，2，WAN Zheng2，KONG Xia1，LIAO Dan1，WANG Zi-you1，HUANG Guoliang2
(1Department of Pathophysiology，2Key Laboratory for Medical Diagnostics of Guangdong Province，Guangdong Medical College，Dongguan 523808，China.E-mail: 44775879@qq.com)

［ABSTRACT］AIM: To study the effect of epigallocatechin-3-gallate (EGCG) on the proliferation of human nasopharyngeal carcinoma (NPC) cells，and to explore its mechanism by targeting miR-34a.METHODS: Nasopharyngeal carcinoma CNE-2Z cells were treated with various concentrations of EGCG.The ability of cell proliferation was detected by CCK-8 assay，5-ethynyl-2-deoxyuridine (EdU) incorporation assay and colony-forming assay.The cell cycle distributions were analyzed by flow cytometry.The protein levels of P53 and Notch1 were detected by Western blot.The expression of miR-34a and Notch1 mRNA was measured by real-time PCR.RESULTS: EGCG effectively inhibited the proliferation and colony formation of CNE-2Z cells in a dose-dependent manner，which was related to its induction of cell cycle arrest at G0/G1phase.The expression of P53 and miR-34a in CNE-2Z cells was significantly increased after treated with EGCG，while the expression of Notch1 at mRNA and protein levels was markedly suppressed.CONCLUSION: EGCG induces cell cycle arrest and suppresses cell proliferation by regulating the P53/miR-34a/Notch1 pathway in NPC cells.

［KEY WORDS］Epigallocatechin-3-gallate; Nasopharyngeal carcinoma; P53; MicroRNA-34a; Notch1

*［基金項(xiàng)目］廣東省建設(shè)中醫(yī)藥強(qiáng)省科研課題(No.20121111)

［收稿日期］2015-03-17

［文章編號］1000-4718(2015)09-1557-06

［中圖分類號］R739.6; R730.23

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.004