張　翠，姜文艷，吳玉梅，莊夢瑋，王西雙，焦　鵬(泰山醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，山東泰安706;勝利油田機(jī)關(guān)醫(yī)院藥劑科，山東東營57000;泰山醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)研究中心，山東泰安706)

抑制自噬促進(jìn)MK-2206誘導(dǎo)SGC-7901胃癌細(xì)胞發(fā)生DNA損傷*

張翠1，姜文艷1，吳玉梅2，莊夢瑋1，王西雙1，焦鵬3△
(1泰山醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，山東泰安271016;2勝利油田機(jī)關(guān)醫(yī)院藥劑科，山東東營257000;3泰山醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)研究中心，山東泰安271016)

［摘要］目的:探討蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)抑制劑MK-2206對胃癌細(xì)胞SGC-7901DNA損傷的影響。方法:不同濃度的MK-2206作用于SGC-7901細(xì)胞后，免疫熒光檢測細(xì)胞內(nèi)DNA損傷標(biāo)記分子磷酸化組蛋白H2AX(γ-H2AX)焦點(diǎn)的生成，Western blot檢測DNA損傷相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，同時(shí)觀察MK-2206對自噬標(biāo)志蛋白LC3-II表達(dá)量的影響，用以確定MK-2206是否促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生自噬。結(jié)果: MK-2206能夠誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞發(fā)生DNA損傷，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX焦點(diǎn)生成，并且激活DNA損傷相關(guān)蛋白的表達(dá); MK-2206作用細(xì)胞后，LC3-II的生成增加;抑制細(xì)胞的自噬顯著增強(qiáng)了MK-2206誘導(dǎo)的H2AX磷酸化水平。結(jié)論: Akt抑制劑MK-2206能夠誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生DNA損傷和自噬，抑制自噬促進(jìn)了MK-2206誘導(dǎo)的DNA損傷。

［關(guān)鍵詞］MK-2206; Akt抑制劑; DNA損傷;γ-H2AX;細(xì)胞自噬

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信號通路參與細(xì)胞的增殖、存活和遷移等多種生命活動過程，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切［1-2］。近年來，該通路多作為研究抗腫瘤治療的靶點(diǎn)［3］。MK-2206是PI3K下游底物分子Akt的變構(gòu)抑制劑，在多種腫瘤中顯示出良好的抑癌活性，具有廣闊的應(yīng)用前景［4-6］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，MK-2206能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡和自噬，協(xié)同促進(jìn)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)的抗腫瘤活性［7］。本研究以SGC-7901胃癌細(xì)胞為研究對象，檢測MK-2206對腫瘤細(xì)胞DNA損傷和自噬的作用，觀察抑制自噬對MK-2206誘導(dǎo)DNA損傷的影響，為MK-2206的臨床用藥提供理論依據(jù)。

材料和方法

1材料

MK-2206購自Selleck Chemicals; RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco; DAPI、氯喹(chloroquine，CQ)、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)、β-actin和LC3-II抗體購自Sigma; p-Akt抗體和細(xì)胞周期檢測點(diǎn)激酶(checkpoint kinase，Chk) 1抗體購自Abcam;磷酸化組蛋白H2AX(phosphorylated histone H2AX，γ-H2AX)抗體、Akt抗體、p-Chk1抗體、Chk2抗體和p-Chk2抗體購自CST; HRP標(biāo)記的Ⅱ抗均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司; FITC標(biāo)記的羊抗兔Ⅱ抗購自Life Technologies。

2主要方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)胃癌細(xì)胞株SGC-7901由本室保存，常規(guī)傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)基采用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。

2.2免疫熒光檢測γ-H2AX焦點(diǎn)細(xì)胞接種于蓋玻片上，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后用不同濃度的MK-2206 (10、20 μmol/L)作用18 h。PBS洗滌玻片2次，4%多聚甲醛固定20 min，Triton X-100打孔5 min，BSA室溫封閉30 min，I抗室溫孵育2 h，加入熒光II抗37℃孵育1 h，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.3Western blot法細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗2次后加入RIPA細(xì)胞裂解液，冰上放置20 min，4℃13 000×g離心20 min，收集上清，然后進(jìn)行蛋白定量。取30 μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉過夜。加入相關(guān)I抗室溫孵育3 h，II抗室溫孵育1.5 h。最后ECL顯色試劑盒于暗室曝光顯影，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4細(xì)胞內(nèi)GFP-LC3融合蛋白的表達(dá)接種SGC-7901細(xì)胞于6孔板中，待細(xì)胞融合至80%左右使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，加入MK-2206繼續(xù)處理24 h，倒置熒光顯微鏡下觀察。GFP-LC3融合蛋白一般呈彌散狀態(tài)分布于胞漿中;當(dāng)細(xì)胞發(fā)生自噬時(shí)，GFP-LC3融合蛋白轉(zhuǎn)位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成明亮的綠色斑點(diǎn)。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較應(yīng)用單因素方差分析，組間兩兩比較應(yīng)用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 MK-2206抑制SGC-7901細(xì)胞內(nèi)Akt的磷酸化水平

Western blot結(jié)果顯示，MK-2206顯著抑制了胃癌SGC-7901細(xì)胞中Akt的磷酸化水平，見圖1。

Figure 1.The effect of MK-2206 on the phosphorylation of Akt in the SGC-7901 cells treated with different concentrations of MK-2206 determined by Western blot.Mean ±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs 0 μmol/L.圖1 Western blot檢測MK-2206對SGC-7901細(xì)胞內(nèi)Akt磷酸化水平的影響

2 MK-2206增加細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX焦點(diǎn)的生成

接著，采用免疫熒光檢測了MK-2206對細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX焦點(diǎn)數(shù)量的影響，從而來確定細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷的變化。從圖中可以看出，SGC-7901細(xì)胞經(jīng)MK-2206作用后，γ-H2AX的焦點(diǎn)數(shù)目明顯增多，且隨著MK-2206濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX焦點(diǎn)數(shù)量呈遞增趨勢。以上結(jié)果表明，MK-2206可能誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞發(fā)生DNA損傷，見圖2。

Figure 2.The formation of γ-H2AX foci in the SGC-7901 cells treated with different concentrations of MK-2206.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs 0 μmol/L.圖2 MK-2206對SGC-7901細(xì)胞中γ-H2AX焦點(diǎn)生成的影響

3 MK-2206上調(diào)DNA損傷相關(guān)蛋白的表達(dá)

20 μmol/L的MK-2206上調(diào)了細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX的蛋白表達(dá);與此同時(shí)，在MK-2206處理的細(xì)胞中，Chk2的磷酸化水平增加，而Chk1的磷酸化水平未見明顯變化，見圖3。

Figure 3.The effect of MK-2206 on the expression of DNA damage-related proteins detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs 0 μmol/L.圖3 Western blot檢測MK-2206對DNA損傷相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

4 MK-2206誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生自噬

轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒的胃癌細(xì)胞經(jīng)MK-2206作用24 h后，熒光顯微鏡觀察到細(xì)胞內(nèi)LC3蛋白的綠色點(diǎn)狀熒光，而對照組綠色熒光呈彌散分布，見圖4。

同時(shí)，免疫印跡檢測了細(xì)胞內(nèi)LC3-II的表達(dá)。從圖中可以看出，MK-2206處理SGC-7901細(xì)胞后，LC3-II的生成量明顯增加;另外，自噬相關(guān)蛋白beclin-1的表達(dá)水平也上調(diào)，見圖5。

Figure 4.The formation of LC3-positive vesicles in MK-2206-treated GFP-LC3 transfected cells.圖4熒光顯微鏡觀察MK-2206處理的SGC-7901細(xì)胞中GFP-LC3熒光的分布

5阻斷自噬促進(jìn)MK-2206誘導(dǎo)的DNA損傷

胃癌細(xì)胞經(jīng)過自噬抑制劑CQ和3-MA預(yù)處理后，促進(jìn)了MK-2206誘導(dǎo)的γ-H2AX表達(dá)，表明抑制自噬能夠促進(jìn)MK-2206誘導(dǎo)的SGC-7901細(xì)胞損傷，見圖6。

Figure 5.MK-2206 increased the expression of beclin-1 and LC3-Ⅱ.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control (0 μmol/L) ;#P＜0.05，##P＜0.01 vs LC3-I.圖5 MK-2206促進(jìn)胃癌細(xì)胞內(nèi)beclin-1和LC3-Ⅱ的表達(dá)

Figure 6.Inhibition of autophagy enhanced MK-2206-mediated H2AX phosphorylation.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs MK-2206.圖6抑制自噬促進(jìn)MK-2206誘導(dǎo)的H2AX磷酸化

討論

損傷DNA是臨床治療腫瘤常用的放、化療治療的手段，自噬與DNA損傷關(guān)系密切［8-9］。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生DNA損傷后，損傷識別因子便對損傷部位進(jìn)行識別并修復(fù)，依據(jù)損傷的類型和程度不同，細(xì)胞會啟動不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。參與DNA損傷應(yīng)答的關(guān)鍵因子有ATM、ATR和DNA-PK，其下游原件包括p53 和Akt等［10］。如果細(xì)胞有能力修復(fù)損傷的DNA，則出現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯，進(jìn)而促進(jìn)DNA損傷修復(fù);當(dāng)DNA損傷嚴(yán)重或修復(fù)能力喪失，細(xì)胞啟動線粒體凋亡通路誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡［11-12］。因此，DNA修復(fù)能力異常激活和增強(qiáng)是導(dǎo)致腫瘤對DNA損傷劑耐藥的重要分子基礎(chǔ)，抑制DNA的修復(fù)則促進(jìn)腫瘤對藥物的敏感性。

H2AX是組蛋白的一個(gè)種類，普遍存在于整個(gè)基因組中。據(jù)報(bào)道，DNA雙鏈斷裂后可誘導(dǎo)位于絲氨酸-139位C-端保守區(qū)域內(nèi)的組蛋白H2AX磷酸化形成γ-H2AX，在熒光顯微鏡下形成可見的γ-H2AX焦點(diǎn)。用特異性抗體的免疫熒光法檢測γ-H2AX已成為衡量DNA雙鏈斷裂(double strand breaks，DSB)的標(biāo)準(zhǔn)［13］。當(dāng)DNA損傷時(shí)，γ-H2AX招募修復(fù)蛋白并在DSB周圍形成焦點(diǎn)。目前，γ-H2AX已經(jīng)成為評價(jià)DSBs發(fā)生的標(biāo)記分子，其形成與DNA雙鏈損傷程度成正比。

調(diào)控細(xì)胞周期是抗腫瘤藥物研究的重要方面。Chk1和Chk2在藥物、電離輻射和紫外線等引起DNA損傷后被ATM和ATR磷酸化激活，在S期和G2期檢測點(diǎn)調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，有可能成為腫瘤治療放化療增敏的新靶點(diǎn)［14］。

在本研究中，我們以胃癌SGC-7901細(xì)胞為研究對象，通過免疫熒光觀察細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX焦點(diǎn)的生成來確認(rèn)MK-2206對DNA損傷的誘導(dǎo)作用;通過免疫印跡檢測細(xì)胞內(nèi)DNA損傷應(yīng)答相關(guān)因子表達(dá)水平的變化來探討MK-2206誘導(dǎo)DNA損傷的可能作用機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)MK-2206處理SGC-7901細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX的焦點(diǎn)增多，γ-H2AX的表達(dá)水平也增加，Chk2的磷酸化水平升高，表明MK-2206能夠誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞發(fā)生損傷，DNA損傷應(yīng)答分子Chk2參與了該過程。

自噬是一種進(jìn)化上高度保守的，由溶酶體介導(dǎo)的動態(tài)過程，是細(xì)胞在某些刺激因素(如DNA損傷、營養(yǎng)缺乏和缺氧等)作用下，細(xì)胞內(nèi)膜性結(jié)構(gòu)包圍并降解損傷的細(xì)胞器或蛋白質(zhì)的過程，參與了調(diào)節(jié)細(xì)胞物質(zhì)的合成、降解和重新利用之間的代謝平衡［15-16］，以達(dá)到細(xì)胞更新作用。在本研究中，我們首先觀察了MK-2206對SGC-7901細(xì)胞自噬的影響。與MK-2206作用于其它腫瘤細(xì)胞類似，MK-2206也能夠誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞發(fā)生自噬。細(xì)胞自噬與DNA損傷間有著密切的關(guān)系。一方面，DNA損傷能誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生，這在多種DNA損傷誘導(dǎo)劑的細(xì)胞毒性模型中都得到了證實(shí);另一方面，自噬同樣參與調(diào)控受損DNA的修復(fù)，參與調(diào)節(jié)多種損傷修復(fù)關(guān)鍵酶的表達(dá)而加速受損DNA的修復(fù)進(jìn)程。

為了探討MK-2206誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞自噬與DNA損傷應(yīng)答的相關(guān)性，我們應(yīng)用自噬特異抑制劑氯喹和3-甲基腺嘌呤來觀察自噬的發(fā)生對MK-2206誘導(dǎo)DNA損傷的影響。研究結(jié)果表明，與MK-2206單藥作用細(xì)胞相比，自噬抑制劑氯喹和3-甲基腺嘌呤聯(lián)合MK-2206處理SGC-7901細(xì)胞，對細(xì)胞內(nèi)γ-H2AX的誘導(dǎo)作用明顯增強(qiáng)。這說明MK-2206誘導(dǎo)的自噬可能是保護(hù)性自噬，它部分抑制了MK-2206誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞DNA損傷。MK-2206和自噬抑制劑的聯(lián)合應(yīng)用可能為胃癌的臨床治療提供新策略。

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(責(zé)任編輯:盧萍，余小慧)

Blocking autophagy magnifies MK-2206-induced DNA damage in SGC-7901 cells

ZHANG Cui1，JIANG Wen-yan1，WU Yu-mei2，ZHUANG Meng-wei1，WANG Xishuang1，JIAO Peng3
(1School of Life Sciences，Taishan Medical University，Tai’an 271016，China;2Department of Pharmacy，Office Hospital of Shengli Oil Field，Dongying 257000，China;3Life Sciences Research Centre，Taishan Medical University，Tai’an 271016，China.E-mail: jiaopeng196@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the effect of MK-2206，an inhibitor of protein kinase B (Akt)，on the DNA damage of SGC-7901 cells.METHODS: SGC-7901 cells were treated with different concentrations of MK-2206，and phosphorylated histone H2AX (γ-H2AX) foci formation was detected by immunofluorescence staining.Western blot analysis was used to exam the levels of DNA damage-related protein.The expression of LC3-Ⅱwas determined to evaluate the change of autophagy.RESULTS: MK-2206 treatment increased the formation of γ-H2AX foci and histone H2AX phosphorylation in the SGC-7901 cells.The levels of DNA damage response protein were also increased.In addition，MK-2206-treated SGC-7901 cells increased the expression of LC3-II，a hallmark of autophagy.Inhibition of autophagy significantly enhanced MK-2206-mediated histone H2AX phosphorylation.CONCLUSION: MK-2206 induces DNA damage and autophagy in SGC-7901 cells.Blocking autophagy potentiates the response of MK-2206-induced DNA damage.

［KEY WORDS］MK-2206; Akt inhibitor; DNA damage;γ-H2AX; Cell autophagy

通訊作者:△ Tel: 0538-6225275; E-mail: jiaopeng196@163.com

*［基金項(xiàng)目］國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81272683) ;山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.ZR2014HL107) ;泰安市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(No.201440774-14)

［收稿日期］2015-03-31［修回日期］2015-06-16

［文章編號］1000-4718(2015)09-1545-05

［中圖分類號］R730.23; R735.2

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.002