張　翠，姜文艷，吳玉梅，莊夢瑋，王西雙，焦　鵬(泰山醫(yī)學院生命科學學院，山東泰安706;勝利油田機關(guān)醫(yī)院藥劑科，山東東營57000;泰山醫(yī)學院生命科學研究中心，山東泰安706)

抑制自噬促進MK-2206誘導SGC-7901胃癌細胞發(fā)生DNA損傷*

張翠1，姜文艷1，吳玉梅2，莊夢瑋1，王西雙1，焦鵬3△
(1泰山醫(yī)學院生命科學學院，山東泰安271016;2勝利油田機關(guān)醫(yī)院藥劑科，山東東營257000;3泰山醫(yī)學院生命科學研究中心，山東泰安271016)

［摘要］目的:探討蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)抑制劑MK-2206對胃癌細胞SGC-7901DNA損傷的影響。方法:不同濃度的MK-2206作用于SGC-7901細胞后，免疫熒光檢測細胞內(nèi)DNA損傷標記分子磷酸化組蛋白H2AX(γ-H2AX)焦點的生成，Western blot檢測DNA損傷相關(guān)蛋白的表達水平，同時觀察MK-2206對自噬標志蛋白LC3-II表達量的影響，用以確定MK-2206是否促進細胞發(fā)生自噬。結(jié)果: MK-2206能夠誘導SGC-7901細胞發(fā)生DNA損傷，促進細胞內(nèi)γ-H2AX焦點生成，并且激活DNA損傷相關(guān)蛋白的表達; MK-2206作用細胞后，LC3-II的生成增加;抑制細胞的自噬顯著增強了MK-2206誘導的H2AX磷酸化水平。結(jié)論: Akt抑制劑MK-2206能夠誘導細胞發(fā)生DNA損傷和自噬，抑制自噬促進了MK-2206誘導的DNA損傷。

［關(guān)鍵詞］MK-2206; Akt抑制劑; DNA損傷;γ-H2AX;細胞自噬

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信號通路參與細胞的增殖、存活和遷移等多種生命活動過程，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切［1-2］。近年來，該通路多作為研究抗腫瘤治療的靶點［3］。MK-2206是PI3K下游底物分子Akt的變構(gòu)抑制劑，在多種腫瘤中顯示出良好的抑癌活性，具有廣闊的應用前景［4-6］。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，MK-2206能夠抑制腫瘤細胞的增殖并誘導細胞發(fā)生凋亡和自噬，協(xié)同促進腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)的抗腫瘤活性［7］。本研究以SGC-7901胃癌細胞為研究對象，檢測MK-2206對腫瘤細胞DNA損傷和自噬的作用，觀察抑制自噬對MK-2206誘導DNA損傷的影響，為MK-2206的臨床用藥提供理論依據(jù)。

材料和方法

1材料

MK-2206購自Selleck Chemicals; RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco; DAPI、氯喹(chloroquine，CQ)、3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)、β-actin和LC3-II抗體購自Sigma; p-Akt抗體和細胞周期檢測點激酶(checkpoint kinase，Chk) 1抗體購自Abcam;磷酸化組蛋白H2AX(phosphorylated histone H2AX，γ-H2AX)抗體、Akt抗體、p-Chk1抗體、Chk2抗體和p-Chk2抗體購自CST; HRP標記的Ⅱ抗均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司; FITC標記的羊抗兔Ⅱ抗購自Life Technologies。

2主要方法

2.1細胞培養(yǎng)胃癌細胞株SGC-7901由本室保存，常規(guī)傳代培養(yǎng)。培養(yǎng)基采用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。

2.2免疫熒光檢測γ-H2AX焦點細胞接種于蓋玻片上，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后用不同濃度的MK-2206 (10、20 μmol/L)作用18 h。PBS洗滌玻片2次，4%多聚甲醛固定20 min，Triton X-100打孔5 min，BSA室溫封閉30 min，I抗室溫孵育2 h，加入熒光II抗37℃孵育1 h，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。實驗重復3次。

2.3Western blot法細胞用預冷的PBS洗2次后加入RIPA細胞裂解液，冰上放置20 min，4℃13 000×g離心20 min，收集上清，然后進行蛋白定量。取30 μg總蛋白進行SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉過夜。加入相關(guān)I抗室溫孵育3 h，II抗室溫孵育1.5 h。最后ECL顯色試劑盒于暗室曝光顯影，實驗重復3次。

2.4細胞內(nèi)GFP-LC3融合蛋白的表達接種SGC-7901細胞于6孔板中，待細胞融合至80%左右使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒。細胞轉(zhuǎn)染24 h后，加入MK-2206繼續(xù)處理24 h，倒置熒光顯微鏡下觀察。GFP-LC3融合蛋白一般呈彌散狀態(tài)分布于胞漿中;當細胞發(fā)生自噬時，GFP-LC3融合蛋白轉(zhuǎn)位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成明亮的綠色斑點。

3統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較應用單因素方差分析，組間兩兩比較應用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1 MK-2206抑制SGC-7901細胞內(nèi)Akt的磷酸化水平

Western blot結(jié)果顯示，MK-2206顯著抑制了胃癌SGC-7901細胞中Akt的磷酸化水平，見圖1。

Figure 1.The effect of MK-2206 on the phosphorylation of Akt in the SGC-7901 cells treated with different concentrations of MK-2206 determined by Western blot.Mean ±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs 0 μmol/L.圖1 Western blot檢測MK-2206對SGC-7901細胞內(nèi)Akt磷酸化水平的影響

2 MK-2206增加細胞內(nèi)γ-H2AX焦點的生成

接著，采用免疫熒光檢測了MK-2206對細胞內(nèi)γ-H2AX焦點數(shù)量的影響，從而來確定細胞內(nèi)的DNA損傷的變化。從圖中可以看出，SGC-7901細胞經(jīng)MK-2206作用后，γ-H2AX的焦點數(shù)目明顯增多，且隨著MK-2206濃度的增加，細胞內(nèi)γ-H2AX焦點數(shù)量呈遞增趨勢。以上結(jié)果表明，MK-2206可能誘導SGC-7901細胞發(fā)生DNA損傷，見圖2。

Figure 2.The formation of γ-H2AX foci in the SGC-7901 cells treated with different concentrations of MK-2206.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs 0 μmol/L.圖2 MK-2206對SGC-7901細胞中γ-H2AX焦點生成的影響

3 MK-2206上調(diào)DNA損傷相關(guān)蛋白的表達

20 μmol/L的MK-2206上調(diào)了細胞內(nèi)γ-H2AX的蛋白表達;與此同時，在MK-2206處理的細胞中，Chk2的磷酸化水平增加，而Chk1的磷酸化水平未見明顯變化，見圖3。

Figure 3.The effect of MK-2206 on the expression of DNA damage-related proteins detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs 0 μmol/L.圖3 Western blot檢測MK-2206對DNA損傷相關(guān)蛋白表達水平的影響

4 MK-2206誘導胃癌細胞發(fā)生自噬

轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒的胃癌細胞經(jīng)MK-2206作用24 h后，熒光顯微鏡觀察到細胞內(nèi)LC3蛋白的綠色點狀熒光，而對照組綠色熒光呈彌散分布，見圖4。

同時，免疫印跡檢測了細胞內(nèi)LC3-II的表達。從圖中可以看出，MK-2206處理SGC-7901細胞后，LC3-II的生成量明顯增加;另外，自噬相關(guān)蛋白beclin-1的表達水平也上調(diào)，見圖5。

Figure 4.The formation of LC3-positive vesicles in MK-2206-treated GFP-LC3 transfected cells.圖4熒光顯微鏡觀察MK-2206處理的SGC-7901細胞中GFP-LC3熒光的分布

5阻斷自噬促進MK-2206誘導的DNA損傷

胃癌細胞經(jīng)過自噬抑制劑CQ和3-MA預處理后，促進了MK-2206誘導的γ-H2AX表達，表明抑制自噬能夠促進MK-2206誘導的SGC-7901細胞損傷，見圖6。

Figure 5.MK-2206 increased the expression of beclin-1 and LC3-Ⅱ.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control (0 μmol/L) ;#P＜0.05，##P＜0.01 vs LC3-I.圖5 MK-2206促進胃癌細胞內(nèi)beclin-1和LC3-Ⅱ的表達

Figure 6.Inhibition of autophagy enhanced MK-2206-mediated H2AX phosphorylation.Mean±SD.n=3.＊＊P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs MK-2206.圖6抑制自噬促進MK-2206誘導的H2AX磷酸化

討論

損傷DNA是臨床治療腫瘤常用的放、化療治療的手段，自噬與DNA損傷關(guān)系密切［8-9］。當細胞發(fā)生DNA損傷后，損傷識別因子便對損傷部位進行識別并修復，依據(jù)損傷的類型和程度不同，細胞會啟動不同的信號轉(zhuǎn)導通路。參與DNA損傷應答的關(guān)鍵因子有ATM、ATR和DNA-PK，其下游原件包括p53 和Akt等［10］。如果細胞有能力修復損傷的DNA，則出現(xiàn)細胞周期阻滯，進而促進DNA損傷修復;當DNA損傷嚴重或修復能力喪失，細胞啟動線粒體凋亡通路誘導細胞發(fā)生凋亡［11-12］。因此，DNA修復能力異常激活和增強是導致腫瘤對DNA損傷劑耐藥的重要分子基礎(chǔ)，抑制DNA的修復則促進腫瘤對藥物的敏感性。

H2AX是組蛋白的一個種類，普遍存在于整個基因組中。據(jù)報道，DNA雙鏈斷裂后可誘導位于絲氨酸-139位C-端保守區(qū)域內(nèi)的組蛋白H2AX磷酸化形成γ-H2AX，在熒光顯微鏡下形成可見的γ-H2AX焦點。用特異性抗體的免疫熒光法檢測γ-H2AX已成為衡量DNA雙鏈斷裂(double strand breaks，DSB)的標準［13］。當DNA損傷時，γ-H2AX招募修復蛋白并在DSB周圍形成焦點。目前，γ-H2AX已經(jīng)成為評價DSBs發(fā)生的標記分子，其形成與DNA雙鏈損傷程度成正比。

調(diào)控細胞周期是抗腫瘤藥物研究的重要方面。Chk1和Chk2在藥物、電離輻射和紫外線等引起DNA損傷后被ATM和ATR磷酸化激活，在S期和G2期檢測點調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，有可能成為腫瘤治療放化療增敏的新靶點［14］。

在本研究中，我們以胃癌SGC-7901細胞為研究對象，通過免疫熒光觀察細胞內(nèi)γ-H2AX焦點的生成來確認MK-2206對DNA損傷的誘導作用;通過免疫印跡檢測細胞內(nèi)DNA損傷應答相關(guān)因子表達水平的變化來探討MK-2206誘導DNA損傷的可能作用機制。我們發(fā)現(xiàn)MK-2206處理SGC-7901細胞后，細胞內(nèi)γ-H2AX的焦點增多，γ-H2AX的表達水平也增加，Chk2的磷酸化水平升高，表明MK-2206能夠誘導SGC-7901細胞發(fā)生損傷，DNA損傷應答分子Chk2參與了該過程。

自噬是一種進化上高度保守的，由溶酶體介導的動態(tài)過程，是細胞在某些刺激因素(如DNA損傷、營養(yǎng)缺乏和缺氧等)作用下，細胞內(nèi)膜性結(jié)構(gòu)包圍并降解損傷的細胞器或蛋白質(zhì)的過程，參與了調(diào)節(jié)細胞物質(zhì)的合成、降解和重新利用之間的代謝平衡［15-16］，以達到細胞更新作用。在本研究中，我們首先觀察了MK-2206對SGC-7901細胞自噬的影響。與MK-2206作用于其它腫瘤細胞類似，MK-2206也能夠誘導SGC-7901細胞發(fā)生自噬。細胞自噬與DNA損傷間有著密切的關(guān)系。一方面，DNA損傷能誘導細胞自噬的發(fā)生，這在多種DNA損傷誘導劑的細胞毒性模型中都得到了證實;另一方面，自噬同樣參與調(diào)控受損DNA的修復，參與調(diào)節(jié)多種損傷修復關(guān)鍵酶的表達而加速受損DNA的修復進程。

為了探討MK-2206誘導的胃癌細胞自噬與DNA損傷應答的相關(guān)性，我們應用自噬特異抑制劑氯喹和3-甲基腺嘌呤來觀察自噬的發(fā)生對MK-2206誘導DNA損傷的影響。研究結(jié)果表明，與MK-2206單藥作用細胞相比，自噬抑制劑氯喹和3-甲基腺嘌呤聯(lián)合MK-2206處理SGC-7901細胞，對細胞內(nèi)γ-H2AX的誘導作用明顯增強。這說明MK-2206誘導的自噬可能是保護性自噬，它部分抑制了MK-2206誘導的胃癌細胞DNA損傷。MK-2206和自噬抑制劑的聯(lián)合應用可能為胃癌的臨床治療提供新策略。

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(責任編輯:盧萍，余小慧)

Blocking autophagy magnifies MK-2206-induced DNA damage in SGC-7901 cells

ZHANG Cui1，JIANG Wen-yan1，WU Yu-mei2，ZHUANG Meng-wei1，WANG Xishuang1，JIAO Peng3
(1School of Life Sciences，Taishan Medical University，Tai’an 271016，China;2Department of Pharmacy，Office Hospital of Shengli Oil Field，Dongying 257000，China;3Life Sciences Research Centre，Taishan Medical University，Tai’an 271016，China.E-mail: jiaopeng196@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the effect of MK-2206，an inhibitor of protein kinase B (Akt)，on the DNA damage of SGC-7901 cells.METHODS: SGC-7901 cells were treated with different concentrations of MK-2206，and phosphorylated histone H2AX (γ-H2AX) foci formation was detected by immunofluorescence staining.Western blot analysis was used to exam the levels of DNA damage-related protein.The expression of LC3-Ⅱwas determined to evaluate the change of autophagy.RESULTS: MK-2206 treatment increased the formation of γ-H2AX foci and histone H2AX phosphorylation in the SGC-7901 cells.The levels of DNA damage response protein were also increased.In addition，MK-2206-treated SGC-7901 cells increased the expression of LC3-II，a hallmark of autophagy.Inhibition of autophagy significantly enhanced MK-2206-mediated histone H2AX phosphorylation.CONCLUSION: MK-2206 induces DNA damage and autophagy in SGC-7901 cells.Blocking autophagy potentiates the response of MK-2206-induced DNA damage.

［KEY WORDS］MK-2206; Akt inhibitor; DNA damage;γ-H2AX; Cell autophagy

通訊作者:△ Tel: 0538-6225275; E-mail: jiaopeng196@163.com

*［基金項目］國家自然科學基金資助項目(No.81272683) ;山東省自然科學基金資助項目(No.ZR2014HL107) ;泰安市科技發(fā)展計劃項目(No.201440774-14)

［收稿日期］2015-03-31［修回日期］2015-06-16

［文章編號］1000-4718(2015)09-1545-05

［中圖分類號］R730.23; R735.2

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.09.002