彭 亮,李詒光,2*,陳 杰*,饒 毅,季巧遇,魏惠珍

(1.江西中醫(yī)藥大學,江西 南昌 330006；2.江中藥業(yè)股份有限公司,江西 南昌330096)

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陜西平利地區(qū)絞股藍黃酮類成分HPLC指紋圖譜研究

彭 亮1,李詒光1,2*,陳 杰1*,饒 毅1,季巧遇1,魏惠珍1

(1.江西中醫(yī)藥大學,江西 南昌 330006；2.江中藥業(yè)股份有限公司,江西 南昌330096)

目的：建立陜西平利地區(qū)絞股藍黃酮類成分的HPLC指紋圖譜。方法：采用反向高效液相色譜法，色譜柱為ZORBAX SB-C18色譜柱(150mm×4.6mm，5μm)；以乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)為流動相進行梯度洗脫；柱溫：30℃；檢測波長：360nm；流速：1.0mL/min；進樣量：10μL。結果：10批絞股藍黃酮類成分HPLC指紋圖譜中共標定了26個共有指紋特征峰，其中2個色譜峰確定為蘆丁和槲皮素，且10批藥材的相似度均達到0.98以上。結論：該方法穩(wěn)定、可靠，精密度高，重復性好，可為絞股藍藥材的質量控制提供依據(jù)。

絞股藍；陜西平利；黃酮類成分；HPLC；指紋圖譜

絞股藍為葫蘆科絞股藍屬多年生草本植物Gynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino.的根莖或全草[1-3]，又名七葉膽、天堂草、遍地生根等。該屬植物基源復雜、品種繁多，全世界約有16種和3變種，我國有14種和3變種[4]，廣泛分布于陜西、湖北、安徽、福建、云南、廣西等地。其味苦微甘，性涼；歸肺、脾、腎經，具有清熱解毒、化痰止咳、益氣健脾、養(yǎng)陰生津、養(yǎng)心安神等功效[5]?，F(xiàn)代研究表明，黃酮類成分是絞股藍的主要化學成分，具有抗氧化、清除自由基、抗癌防癌、改善心腦血管循環(huán)和調節(jié)血壓等作用[6-8]。絞股藍作為一種與人參相似的免疫增強劑，有“南方人參”的美譽，民間稱其為神奇的“不老長壽藥草”，在保健食品和新型藥品研發(fā)上都有巨大的應用前景，是一種新的藥食兩用植物資源[9-12]。目前，關于陜西平利地區(qū)絞股藍藥材黃酮類成分指紋圖譜研究未見文獻報道，為進一步評價該地區(qū)絞股藍藥材質量，本研究建立了陜西平利產地絞股藍黃酮類成分的HPLC指紋圖譜，并對10批絞股藍黃酮類成分的HPLC指紋圖譜進行評價分析，以便能更加全面地反映該地區(qū)絞股藍藥材的質量現(xiàn)狀，為絞股藍藥材的質量控制和道地藥材GAP實施提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)，包括 G1379A 在線真空脫氣機、G1311A 四元泵、G1367A 自動進樣器、G1316A 柱溫箱和 G1315B DAD檢測器；SK5200LH超聲波清洗器(上?？茖С晝x器有限公司)；AB204-N型精密分析天平(METTLER TOLEDO上海衡器有限公司)；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)。

1.2 試藥

絞股藍藥材經鑒定為葫蘆科絞股藍屬多年生草本植物Gynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino的根莖或全草，藥材來源見表1。蘆丁對照品(批號為100080-200707，中國食品藥品檢定研究院)，槲皮素對照品(批號為100081-200907，中國食品藥品檢定研究院)。甲醇、乙腈為色譜純；水為娃哈哈飲用純凈水；其它試劑均為分析純。

表1 絞股藍藥材樣品來源

2 方法與結果

2.1 對照品溶液制備

取蘆丁、槲皮素對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解制成含蘆丁253.5μg·mL-1、槲皮素3.62μg·mL-1的對照品溶液。

2.2 供試品溶液制備

取絞股藍藥材干燥粉末(過四號篩)約1.0g，精密稱定，置索氏提取器中，加石油醚(60～90℃)適量，加熱回流至提取液無色，放冷，棄去石油醚液，藥渣連同濾紙揮干溶劑，移入具塞錐形瓶中，加入70%甲醇溶液50mL，稱定重量，回流提取1.0h，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，過濾，濾液蒸干，殘渣用甲醇溶解并轉移至25mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件

ZORBAX SB-C18色譜柱 (150mm×4.6mm，5μm)；以乙腈(A)-0.2%磷酸水溶液(B)為流動相進行梯度洗脫，梯度洗脫條件見表2。柱溫：30℃；檢測波長：360nm；流速：1.0mL/min；進樣量：10μL。

2.4 測定方法

分別吸取對照品溶液與供試品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，按“2.3”項下色譜條件測定，記錄55min色譜圖。供試品色譜圖中，以蘆丁峰作為參照峰(s)，指定其相對保留時間和相對峰面積為1，計算其它特征指紋峰的相對保留時間和相對峰面積的比值。

表2 梯度洗脫條件

2.5 方法學考察

2.5.1 精密度考察 取同一份絞股藍供試品溶液，按“2.3”項所述色譜條件連續(xù)進樣6次，并記錄色譜圖。選取蘆丁色譜峰作為參照峰，計算其他特征峰對其的相對保留時間和相對峰面積。結果各特征峰的相對保留時間RSD值小于0.33%，相對峰面積RSD值小于4.77%。結果表明，該方法精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性考察 取絞股藍藥材干燥粉末(批號：2014.02.19，過四號篩)，按“2.2”項下制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件在0、2、4、8、12、24h依次進樣，記錄不同時間的色譜圖，計算各特征峰相對于蘆丁峰的相對保留時間值和相對峰面積值。結果各特征峰的相對保留時間RSD值小于0.15%，相對峰面積RSD值小于4.98%。結果表明，樣品在24h內穩(wěn)定性良好。

2.5.3 重復性考察 取同一批絞股藍藥材干燥粉末(批號：2014.02.19，過四號篩)6份，按“2.2”項下制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件分別進樣測定，記錄色譜圖。計算各特征峰相對于蘆丁峰的相對保留時間值和相對峰面積值。結果各特征峰的相對保留時間RSD值小于0.29%，相對峰面積RSD值小于4.86%。結果表明，所建立的指紋圖譜方法能夠實現(xiàn)較好的重復性。

2.6 指紋圖譜及技術參數(shù)

2.6.1 絞股藍黃酮類成分指紋圖譜建立 按“2.2”項下供試品溶液制備方法和“2.3”項下色譜條件分析陜西平利地區(qū)的10批絞股藍藥材，得到10批絞股藍黃酮類成分HPLC指紋圖譜，見圖1。55 min內有26個特征指紋峰是10批絞股藍藥材所共有，每張指紋圖譜中所選共有峰的峰面積總和大于總峰面積的90%。

2.6.2 特征指紋峰的標定 根據(jù)相對保留時間標定特征指紋峰，對10批絞股藍HPLC-FPS測定結果進行比較分析，發(fā)現(xiàn)26個特征峰是10批絞股藍所共有，因此確定這26個峰為特征指紋峰。其中，通過對照品HPLC圖譜確定1號峰為蘆丁，14號峰為槲皮素，見圖2。以1號峰(蘆丁)為參照峰，計算其他特征峰相對于1號峰的相對保留時間和相對峰面積，見表3、表4。

圖1 陜西平利地區(qū)10批絞股藍黃酮類成分對照指紋圖譜

圖2 絞股藍黃酮類成分HPLC指紋圖譜

2.7 相似度評價

采用國家藥典委員會頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng) (2004A版)”，對10批絞股藍藥材進行相似度評價分析，以中位數(shù)生成參照譜，時間窗寬度為0.02。結果表明：10批絞股藍藥材指紋圖譜相對參照譜的相似度結果分別為0.995、0.998、0.995、0.997、0.991、0.988、0.994、0.984、0.995、0.993。由相似度結果可知，10批藥材的指紋圖譜與對照譜相比較，其相似度均達到0.98以上，表明藥材質量穩(wěn)定，差異較小。

3 討論

采用HPLC-UV檢測分析發(fā)現(xiàn)，在360nm波長處指紋峰較多，多數(shù)特征成分的響應值較大，而且基線較平穩(wěn)，故選擇360nm波長作為指紋圖譜檢測波長。本實驗分別采用甲醇-水、甲醇-0.2%磷酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸水溶液進行梯度洗脫。結果表明，在乙腈-0.2%磷酸水溶液的流動相中，各色譜峰的分布、峰形和分離度均優(yōu)于其他流動相系統(tǒng)，因此，選擇乙腈-0.2%磷酸水溶液作為流動相。

實驗以盡可能多體現(xiàn)絞股藍中黃酮成分為原則，以提取溶劑、提取方式、提取時間為優(yōu)化對象，采用單因素試驗確定絞股藍藥材中黃酮類成分提取的最佳條件，最終確定了以石油醚回流除去脂溶性干擾性成分，再以70%甲醇回流提取1.0h效果最好。

通過對10批陜西平利絞股藍藥材HPLC指紋圖譜的分析結果可知，各色譜峰的保留時間匹配較好，且各特征峰的相對含量分布相似，10批絞股藍藥材的總相似度均達到0.98以上，所建立的HPLC指紋圖譜可用于辨別不同產地的絞股藍藥材。

表3 10批絞股藍指紋圖譜中共有特征峰相對保留時間

表4 10批絞股藍指紋圖譜中共有特征峰相對峰面積

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(責任編輯：魏 曉)

Study on the HPLC Fingerprint Spectrum of Flavonoids inGynostemmaPentaphyllum(Thunb.) Makino from Shanxi PingLi

Peng Liang1,Li Yiguang1,2*,Chen Jie1*,Rao Yi1,Ji Qiaoyu1,Wei Huizhen1

(1.Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine,Nanchang 330006,China;2.Jiangzhong Pharmaceutical Corporation,Nanchang 330096,China)

Objective:To establish the HPLC fingerprint spectrum of flavonoids inGynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino.Methods:HPLC was performed on ZORBAX SB-C18column (150mm×4.6mm,5μm),gradiently eluting with acetonitrile as mobile phase A,and 0.2% H3PO4as B at a flow rate of 1.0mL/min.The column temperature was 30℃.The detection wavelength was 360nm.The injection volume was 10μL.Results:Twenty-six common characteristic peaks were demarcated among ten batches ofGynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino.Two chromatographic peaks were identified as rutin and quercetin and the similarities of ten batches ofGynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino were above 0.98.Conclusion:The established method is simple,accurate and can be able to provide reference for quality control ofGynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino.

Shanxi PingLi；GynostemmaPentaphyllum(Thunb.) Makino；Flavonoids；HPLC；Fingerprint Spectrum

2015-05-08

彭亮(1990-),男,江西中醫(yī)藥大學碩士研究生,研究方向為中藥質量控制。

李詒光(1974-),男,江中藥業(yè)股份有限公司主任中藥師，研究方向為中藥質量評價與開發(fā)，E-mail:lyg@jzjt.com；陳杰(1975-),女,江西中醫(yī)藥大學副教授,研究方向為中藥質量評價與開發(fā)，E-mail:813680107@qq.com。

R284.1

A

1673-2197(2015)19-0019-04

10.11954/ytctyy.201519009