賈福懷，陶 剛，吳國卿

(寧波御坊堂生物科技有限公司，浙江 寧波 315012)

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一種增強免疫力中藥制劑的研發(fā)

賈福懷，陶 剛*，吳國卿

(寧波御坊堂生物科技有限公司，浙江 寧波 315012)

目的：優(yōu)化一種增強免疫力復(fù)方中藥制劑的提取工藝，并對研制的復(fù)方中藥制劑進行穩(wěn)定性、安全性毒理學(xué)評價及功能性評價。方法：以粗多糖、總皂苷和淫羊藿苷含量為指標，以中藥炙黃芪、淫羊藿、人參、熟地黃、茯苓、甘草為原料，應(yīng)用正交實驗法優(yōu)化提取工藝，并對標志性成分的穩(wěn)定性、滅菌工藝進行驗證和評價，并依據(jù)衛(wèi)生部《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》對研制的復(fù)方中藥制劑進行安全性毒理學(xué)評價及功能評價。結(jié)果：最佳提取工藝條件為：初次提取按料液比1∶10煎煮2h，第2次提取按料液比1∶8煎煮1h?？诜褐袠酥拘猿煞志休^好的穩(wěn)定性，在24個月保質(zhì)期中可以保證產(chǎn)品質(zhì)量的要求。滅菌條件的滅菌效果重現(xiàn)性很好，滅菌工藝條件穩(wěn)定可靠。安全毒理學(xué)評價各項指標均未見明顯毒性反應(yīng)，功能評價為：受試樣品高劑量組ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細胞增殖能力和小鼠左后足跖部24h與0h厚度測量值差值均增加，差異均有顯著性。 結(jié)論：建立的提取方法具有提取效率高、工藝簡單等優(yōu)點，經(jīng)過安全性毒理學(xué)試驗證明屬于無毒性產(chǎn)品，經(jīng)功能學(xué)試驗證明具有增強免疫力的保健功能，長期食用可改善體質(zhì)、增強免疫力。

復(fù)方中藥制劑；增強免疫力；中藥研制；穩(wěn)定性、安全性；毒理學(xué)

現(xiàn)代社會，很多疾病發(fā)生的深層原因是免疫力低下或免疫力不健全。人體免疫系統(tǒng)完善，則機體和諧、健康；反之機體受損，表現(xiàn)為易感染或者易生病狀態(tài)。“正氣存內(nèi)，邪不可干，邪之所湊，其氣必虛”，正氣就是指人體的抗病能力，也就是免疫力[1]，正氣不足表現(xiàn)為虛癥，注意保護免疫系統(tǒng)不受損害至關(guān)重要。

單一的藥物只能控制或者緩解某些癥狀，很難徹底緩解免疫力低下的復(fù)雜身體狀況，復(fù)方可以提高療效，減少毒副作用。人體免疫系統(tǒng)存在著一定的動態(tài)平衡，許多中藥對人體免疫力的調(diào)節(jié)有著先天優(yōu)勢。本中藥制劑進行復(fù)方配伍時遵循“君臣佐使”這一重要原則，以炙黃芪和淫羊藿為君藥，對增強免疫力起主要作用；輔以常用中藥人參、茯苓，能夠補氣生血，增強機體免疫力，起到協(xié)調(diào)配合君藥的療效；人參和黃芪皆為重要的補氣扶正藥，兩者合用旺氣生血，可增強機體免疫調(diào)節(jié)功能[2]；同時熟地黃溫和滋陰、益精填髓[3]，甘草緩和矯正陽性藥物的火烈藥性、解毒滋補。本復(fù)方可以緩和因人體衰老、生活工作壓力過大等原因產(chǎn)生的免疫力下降等一系列身體狀況，達到肝腎陰陽同補、固本扶元、祛邪調(diào)理的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料 炙黃芪、淫羊藿、人參、熟地黃、茯苓、甘草(安徽濟人藥業(yè)有限公司)；低聚果糖(量子高科(中國)生物股份有限公司)；山梨酸鉀(羅蓋特精細化工有限公司)。

1.1.2 設(shè)備 Agilent 1260高效液相色譜，數(shù)顯恒溫水浴鍋，梅特勒-托利多pH計，電子分析天平，紫外可見分光光度計，阿貝折射儀，超聲波清洗器，低速離心機，水浴檢漏滅菌柜，高速管式離心機，自動鎖口機，鼓風(fēng)干燥箱，恒溫恒濕箱，提取濃縮罐。

1.2 測定方法

感官：感官鑒定法；可溶性固形物：GB/T 12143；pH：《中華人民共和國藥典》(2010年版)一部附錄Ⅶ G；重金屬、農(nóng)藥殘留：GB 5009；粗多糖：硫酸苯酚法；總皂苷：《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》(2003版)規(guī)定方法；淫羊藿苷：GB/T 22247；微生物指標：GB 4789；安全性毒理學(xué)試驗、功能性實驗：衛(wèi)生部《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》(2003年版)[6]。

1.3 工藝流程

中藥→切片→一次煎煮→過濾→二次煎煮→過濾→合并濾液→離心→濃縮→復(fù)配(低聚果糖、山梨酸鉀、純化水)→煮沸滅菌→冷卻→灌裝→鎖口→熱壓滅菌→冷卻→貼標→裝盒→裝箱。

1.4 制劑工藝要點

1.4.1 提取 中藥炙黃芪、淫羊藿、人參、熟地黃、茯苓、甘草以3∶2∶1∶1∶1∶0.5的比例準確稱量并作相應(yīng)的切片處理，混合均勻后投入中藥提取設(shè)備中加入總藥重10倍量的純化水，夾套中通入蒸汽加熱，煎煮2h，過濾，得到第1次濾液和濾渣，濾渣繼續(xù)加入總藥重8倍量的純化水煎煮1h，過濾，得到第2次濾液。

1.4.2 離心、濃縮 將2次濾液合并，經(jīng)過高速管式離心機離心處理(15 000r/min，蠕動泵上料)去除沉淀，使用中藥濃縮設(shè)備減壓濃縮至相對密度1.12～1.14(真空度-0.08MPa)。

1.4.3 配料、灌裝 濃縮液轉(zhuǎn)移入配料罐中，加入占濃縮液總重量50%的低聚果糖糖漿、0.4%的山梨酸鉀(用少量純化水溶解)，250%的純化水，配制成口服液，將該口服液煮沸20min，循環(huán)水冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至灌裝設(shè)備，使用鈉鈣玻璃瓶灌裝至規(guī)定的裝量，用鋁制防盜蓋自動鎖口機鎖口。

1.4.4 滅菌 采用真空檢漏滅菌柜熱壓滅菌方式滅菌(工藝參數(shù)溫度121℃，時間20min)，

1.4.5 成品 產(chǎn)品放冷后轉(zhuǎn)入后續(xù)包裝工序貼標、噴碼、裝盒、裝箱即得成品入庫。

1.5 口服液包裝優(yōu)點

本復(fù)方中藥制劑考慮采用口服液的劑型，鈉鈣玻璃藥瓶包裝，鋁制防盜蓋密封，安全衛(wèi)生，不會造成交叉污染、受潮結(jié)塊等狀況，更有以下優(yōu)點：有效成分分散在介質(zhì)中，分散度大、吸收快，能較迅速發(fā)揮作用；能減少成分的刺激性，生物利用度高；易于區(qū)分劑量，食用方便。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件的確定

炙黃芪、人參、甘草、茯苓及熟地黃中均含多糖類成分，人參中含有大量的人參皂苷，淫羊藿主要含以淫羊藿苷為主的黃酮類成分，故確定本品的標志性成分為粗多糖、總皂苷和淫羊藿苷。多糖類是極性較大的成分，水和稀醇作為溶媒對多糖類的提取效果較好；總皂苷的提取方法[4]使用較多的是水提煎煮法和醇提回流法，煎煮法得到的浸膏量較多，各物質(zhì)溶出效果好，而乙醇回流法提取皂苷率都在8%以上，皂苷含量高；淫羊藿苷根據(jù)其理化性質(zhì)，用乙醇溶液作為提取溶媒能更多地提取出淫羊藿苷，這也與趙燕燕[5]報道的淫羊藿苷提取條件篩選正交試驗設(shè)計結(jié)果，最佳提取工藝為20倍量，70%乙醇提取3次，每次0.5h相符，但是本品為復(fù)方制劑，各原料配伍后綜合起效，所以提取條件不能簡單地以淫羊藿苷提取量多少來確定。水提取法是既簡單又經(jīng)濟的中藥口服液提取方法，且也符合中藥傳統(tǒng)的食用方法(水煎煮法)，而醇提法會損失絕大部分有益的多糖成分，因此本產(chǎn)品采用傳統(tǒng)的水提取法結(jié)合試驗篩選，初步確定采用第1次加入10倍量水提取2h，第2次加入8倍量水提取1h，并對此條件進行了3次驗證試驗，具體操作：稱取炙黃芪120g、淫羊藿80g、人參40g、熟地黃40g、茯苓40g、甘草20g共3份，分別加10倍、8倍量水提取2次，第1次提取2h，第2次提取1h，過濾，合并濾液，加熱濃縮，復(fù)配成成品并測定粗多糖、總皂苷和淫羊藿苷的提取量，結(jié)果見表1。

經(jīng)3批試驗結(jié)果表明，傳統(tǒng)水提法工藝穩(wěn)定、可行，故確定提取工藝條件為：10倍量水提取2h，過濾；8倍量水提取1h，過濾；合并2次濾液。

表1 提取條件驗證試驗結(jié)果 (mg/100mL)

2.2 標志性成分的穩(wěn)定性

對口服液產(chǎn)品在37℃和相對濕度75%的恒溫恒濕箱中加速試驗3個月，每月測定口服液中粗多糖、總皂苷、淫羊藿苷的含量，經(jīng)過3個月的加速實驗，標志性成分的變化趨勢見圖1、圖2、圖3。

圖1 3個月加速試驗中粗多糖含量變化

圖2 3個月加速試驗中總皂苷含量變化

圖3 3個月加速試驗中淫羊藿苷含量變化

本批次口服液經(jīng)過3個月的加速試驗，標志性成分含量都有所降低，其中粗多糖含量減少2.98%，總皂苷含量減少7.14%，淫羊藿苷含量減少2.93%，降幅不是很大，加速完成的產(chǎn)品中3項指標含量分別為912mg/100mL、117mg/100mL、9.95mg/100mL，仍高于指標要求，因此，該口服液中標志性成分均有較好的穩(wěn)定性，在保質(zhì)期24個月中可以保證產(chǎn)品質(zhì)量。

2.3 滅菌工藝的驗證

2.3.1 驗證方法 使用121度壓力蒸汽滅菌生物指示劑(型號ATCC7953，嗜熱脂肪桿菌芽孢)嗜熱脂肪桿菌芽胞嗜熱脂肪桿菌芽胞做滅菌工藝驗證。熱壓滅菌效果與滅菌時間、溫度、產(chǎn)品裝載密度等工藝條件有關(guān)，將滅菌時間設(shè)為10min、20min、30min，在水浴檢漏滅菌柜內(nèi)放置待滅菌產(chǎn)品，并在滅菌柜前后門處產(chǎn)品的上部、中部、下部各放置一支壓力蒸汽滅菌生物指示劑，溫度上升至T=121℃，工作壓力P=150kPa、滅菌時間參考工藝參數(shù)，降溫取出滅菌產(chǎn)品及生物指示劑，指示劑置于56～60℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后取出觀察顏色變化，另取一支未經(jīng)滅菌的生物指示劑一起培養(yǎng)，作為陽性對照。

2.3.2 結(jié)果判斷 在同一個滅菌器中采用不同的滅菌時間進行3次滅菌試驗，滅菌時間分別為10min、20min、30min。根據(jù)56～60℃ 培養(yǎng)48h后生物指示劑顏色判斷滅菌效果，培養(yǎng)后生物指示劑全部保持紫色則滅菌合格，如有一支由紫色變?yōu)辄S色則為不合格，對照管由紫色變?yōu)辄S色證明該指示劑有效。驗證數(shù)據(jù)見表2。

表2 不同滅菌時間對滅菌效果的影響驗證試驗結(jié)果

2.3.3 結(jié)論 121℃、10min滅菌不合格，證明這個條件下滅菌仍有風(fēng)險，不宜采用，20min和30min的滅菌參數(shù)條件下，滅菌都是合格的，考慮到生產(chǎn)實際情況和能源消耗，采用121℃、20min滅菌工藝參數(shù)，并作重現(xiàn)性試驗驗證此工藝參數(shù)。根據(jù)上述試驗結(jié)論選擇滅菌時間20min，重復(fù)3次滅菌過程，生物指示劑放置的位置同之前的驗證要求一致，驗證滅菌效果的重現(xiàn)性。結(jié)果3次滅菌的生物指示劑經(jīng)56～60℃ 培養(yǎng)48h后，均未變色(保持紫色)，陽性對照管變黃色，證明此滅菌條件的滅菌效果重現(xiàn)性良好，滅菌工藝條件穩(wěn)定可靠。

3 安全性毒理學(xué)評價及功能評價

檢測依據(jù)：衛(wèi)生部《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》(2003年版)[6]。

3.1 安全性毒理學(xué)評價

用本品口服液樣品制作濃縮液(濃縮比例10∶1)，無菌包裝，實驗時以濃縮液原液作為受試物，以蒸餾水為溶媒將樣品配制成不同濃度的樣品液供試。

大小鼠急性經(jīng)口毒性試驗，選用SD大鼠和ICR小鼠，采用最大耐受劑量法，設(shè)樣品40.0g/kg一個劑量組，經(jīng)口灌胃方式給受試物，觀察一般狀況、中毒癥狀和死亡情況，觀察期限為2周。染毒后，觀察期內(nèi)均未見大小鼠出現(xiàn)中毒和死亡狀況，雌雄兩性急性經(jīng)口最大耐受劑量均大于40.0g/kg體重，屬于無毒類。

用10倍濃縮液進行Ames試驗，試驗菌株選用組氨酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌TA97 、TA98 、TA100 、TA102，結(jié)果為陰性，小鼠骨髓細胞微核試驗和小鼠精子畸形試驗，選用ICR小鼠，設(shè)樣品5.0、10.0和20.0g/kg體重三個劑量組，結(jié)果均為陰性，表明本品無致突變特性。

大鼠30天喂養(yǎng)實驗，試驗樣品為產(chǎn)品的10倍濃縮液，設(shè)三個劑量組及陰性對照組，分別相當于人推薦攝入量的25、50、100倍，實驗時用蒸餾水稀釋成不同劑量濃度供試，大鼠選用SD大鼠80只，隨機分成四組，每組20只，雌雄各半。實驗期間，各組大鼠均未見異常癥狀和體征，也無死亡，各劑量組各項指標均未見明顯毒性反應(yīng)，與陰性對照組比較差異均無顯著性(P>0.05)。

3.2 增強免疫力功能性試驗評價

3.2.1 方法 供試樣品為產(chǎn)品的10倍濃縮液，產(chǎn)品人推薦劑量為40mL/60kg/日，相當于產(chǎn)品的10倍濃縮液4mL/60kg/日。實驗設(shè)三個劑量組和陰性對照組(蒸餾水)。低、中、高三個劑量為產(chǎn)品的10倍濃縮液0.33、0.67和2.0mL/kg體重，相當于人推薦量的5倍、10倍和30倍。實驗用清潔級ICR小鼠，雌性，體重(20±2)g。連續(xù)30～35天經(jīng)口給予不同劑量的受試樣品，陰性對照組給予蒸餾水。

3.2.2 結(jié)果 與陰性對照組比較，受試樣品低、中劑量組小鼠溶血空斑數(shù)均增加，差異均有顯著性；與陰性對照組比較，受試樣品中劑量組小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的吞噬百分率和吞噬指數(shù)均升高，差異均有顯著性；與陰性對照組比較，受試樣品高劑量組ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細胞增殖能力和小鼠左后足跖部24h與0h厚度測量值差值均增加，差異均有顯著性。說明本口服液具有增強免疫力的功能。

4 產(chǎn)品質(zhì)量控制

該產(chǎn)品按照以下質(zhì)量標準嚴格控制質(zhì)量，保障產(chǎn)品品質(zhì)。

4.1 感官評價

棕色至棕褐色液體，無肉眼可見外來雜質(zhì)，允許有少量沉淀，味苦回甘，具有原料中藥特有的氣味。

4.2 微生物指標

菌落總數(shù)≤50cfu/mL，大腸菌群≤6MPN/100mL，霉菌和酵母均≤10cfu/mL，致病菌皆不得檢出。

4.3 標志性成分指標

粗多糖含量(以葡萄糖計)≥800mg/100mL，總皂苷(以人參皂苷Re計)≥100mg/100mL，淫羊藿苷≥7.0mg/100mL。

4.4 理化指標

可溶性固形物≥12g/100mL，pH為3.5～5.0，鉛含量(以Pb計)≤0.5mg/kg，砷含量(以As計)≤0.3mg/kg。

4.5 農(nóng)藥殘留指標

六六六≤0.1mg/kg，滴滴涕≤0.1mg/kg。

5 討論

現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快使人們休息睡眠不足、超負荷工作、缺乏鍛煉，使疲勞和免疫力下降，慢性疾病增多。要預(yù)防或減少免疫力低下導(dǎo)致的疾病，除了要增強自我保健意識、養(yǎng)成良好的生活習(xí)慣外，采取一定的干預(yù)措施十分必要。保健食品具有一定的保健功能，且安全性高、可長期服用，又可滿足人們?nèi)粘１＝〉男枨?，可大大增強早期預(yù)防的意義和價值。

本制劑是針對免疫力下降綜合征，結(jié)合現(xiàn)代中藥藥理研究成果，以藥食同源類或可用于保健食品的中藥炙黃芪、淫羊藿、人參、熟地黃、茯苓、甘草等為主要原料經(jīng)過提取濃縮、離心滅菌等工藝操作制成保健食品，經(jīng)過安全性毒理學(xué)試驗證明屬于無毒性產(chǎn)品，經(jīng)功能學(xué)試驗證明具有增強免疫力的保健功能，長期食用可達到改善體質(zhì)、增強免疫力的功效。

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[5] 趙燕燕，徐本明，姜斌，等.淫羊藿總黃酮提取工藝對總黃酮和淫羊藿苷含量的影響[J].煙臺大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)與工程版，2007,20(1):22-25.

[6] 中華人民共和國衛(wèi)生部.保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范[Z].2003.

(責(zé)任編輯：宋勇剛)

2014-12-05

賈福懷(1963—)，男，寧波御坊堂生物科技有限公司高級工程師，研究方向為健康產(chǎn)品開發(fā)。

陶剛(1984—)，男，寧波御坊堂生物科技有限公司工程師，研究方向為保健功能食品研發(fā)。

R284

A

1673-2197(2015)07-0021-03

10.11954/ytctyy.201507011