李文淵，王津慧，童 麗，楊 靖，熱增才旦，索南鄧登，楊 芳

(青海大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810001)

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藏藥吉子恩保(甘西鼠尾草)DNA提取方法比較

李文淵，王津慧，童 麗，楊 靖，熱增才旦，索南鄧登，楊 芳

(青海大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810001)

目的：建立藏藥吉子恩保(甘西鼠尾草)DNA的提取方法，為進(jìn)一步開展分子生藥學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。方法：比較SDS法和改良CTAB法，運(yùn)用紫外分光光度計和電泳分析方法測定所得DNA樣品的純度和濃度。結(jié)果與結(jié)論：兩種方法中改良CTAB法所得的DNA質(zhì)量較高。

吉子恩保；甘西鼠尾草；DNA提取

甘西鼠尾草(SalviaprzewalskiiMaxim.)(藥材名：甘肅丹參)為唇形科鼠尾草屬植物，藏藥名吉子恩保(音譯)，與大宗常用中藥丹參為同科植物，其有效成分與中藥丹參相似，功能主治亦與丹參相同，在西南、西北地區(qū)甘西鼠尾草普遍作為臨床治療心血管疾病中藥丹參的替代品種[1]。早在20世紀(jì)80年代，科研工作者就展開了鼠尾草屬植物的篩選工作，在“七五”國家重點(diǎn)科技攻關(guān)項目“丹參類專題研究”中得出結(jié)論：綜合比較測定結(jié)果，以甘西鼠尾的有效成分含量高，藥理作用最強(qiáng)，質(zhì)量最好，植物資源豐富，且已有商品在全國流通，值得推廣應(yīng)用[2]。

此外，甘西鼠尾草作為丹參藥材的重要資源之一，有文獻(xiàn)報道其品質(zhì)甚至超過正品丹參，但目前對于其開發(fā)利用力度遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，研究多集中于有效成分含量測定[3]、簡單藥理作用[4]、資源調(diào)查之類[5]，用分子生物學(xué)方法對其遺傳多樣性、資源評價、分子標(biāo)記等方面的研究論文甚少。高質(zhì)量的DNA是開展上述工作的前提，本文擬研究獲得高質(zhì)量甘西鼠尾草DNA的實(shí)驗(yàn)方法，為開展后續(xù)分子生藥學(xué)[6]研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與試劑

1.1 材料

甘西鼠尾草材料分別采自青海省黃南藏族自治州、甘肅武威市、甘肅省甘南州、青海省互助縣，見表1。樣品經(jīng)青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系王津慧教授鑒定為甘西鼠尾草。硅膠快速干燥后置于-20℃冰箱保存。

1.2 主要試劑

十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)(國藥集團(tuán))、三羥甲基氨基甲烷(Tris)(Solarbio)、β-巰基乙醇(AMRESCO)、EDTA(國藥集團(tuán))、SDS(國藥集團(tuán))、溴化乙錠(EB)(Sigma)、瓊脂糖(GENETECH)，其它試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 主要儀器

冷凍離心機(jī)(Eppendorf)、紫外可見分光光度計(上海精科)、 凝膠成像系統(tǒng)(Tanon)、電泳儀( 北京市六一儀器廠)、水浴鍋( 東方電工)。

表1 供試材料信息

2 方法

2.1 SDS法

稱取甘西鼠尾草干燥材料0.3g，置于液氮研磨成粉，加入SDS抽提緩沖液(100mmol/LTris-HCl(PH8.0)、50mmol/L EDTA(PH8.0)、50mmol/L NaCl、10mmol/L β-巰基乙醇900μL和10%SDS 100μL，反復(fù)搖勻，于65℃水浴1h。12 000r/min離心10min，取上清液。加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25/24/1)搖勻，12 000r/min離心10min，取上層溶液，加入2/3倍體積的冷異丙醇，搖勻，放入-20℃冰箱中，30min。離心12 000r/min，5min，倒掉溶液，加入70%乙醇洗滌2次最后將沉淀溶于50μL ddH2O中。

2.2 改良CTAB法

稱取甘西鼠尾草干燥材料0.3g，經(jīng)液氮冷凍后研磨成粉末狀,立即轉(zhuǎn)入65℃預(yù)熱后的900μLCTAB提取緩沖液(2%CTAB,疏基乙醇)中,充分振搖使材料與提取液混合均勻，于65℃保溫90min,其間輕輕倒轉(zhuǎn)離心管數(shù)次,冷卻至室溫,加入等體積氯仿/異戊醇(24∶1)抽提,搖勻5～10min,靜置分相,4℃離心(10 000r/min,10min),將上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中,重復(fù)以上步驟至兩相分界明顯,取上清液加入新的1.5mL離心管中,加入500μL純異丙醇(-20℃冷凍)。沉降DNA,輕輕顛倒2～3次,可見白色絮狀沉淀,-20℃冰箱中靜置15min,離心(12 000r/min，10min)。加入500μL75%乙醇洗滌1次,純乙醇洗滌1次, 12 000r/min離心5min，倒掉洗液，通風(fēng)櫥吹干約1h，待總DNA干燥后,加入50μL ddH2O。

2.3 DNA質(zhì)量檢測

將DNA提取液稀釋100倍后，用紫外分光光度計觀測在紫外光260nm和280nm處的吸收值A(chǔ)260、A280，并以A260/A280的比值鑒定純度。DNA濃度(ng/μL)=A260×50μg×稀釋倍數(shù)，結(jié)果見表2。采用1.5%瓊脂糖電泳，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照，見圖1。

表2 不同提取方法DNA質(zhì)量比較

圖1 不同提取方法DNA凝膠電泳

3 討論

植物基因組DNA質(zhì)量的好壞決定后續(xù)PCR實(shí)驗(yàn)的成敗，因此，植物基因組DNA的提取是分子生藥學(xué)實(shí)驗(yàn)的一個重要環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)以藏藥吉子恩保的原植物甘西鼠尾草經(jīng)硅膠快速干燥的新鮮葉片作為供試品材料，提取DNA作為后續(xù)PCR反應(yīng)的模板，根據(jù)文獻(xiàn)報道，本實(shí)驗(yàn)嘗試用步驟較為簡便的改良CTAB法和SDS法分別進(jìn)行DNA的提取。由表2可知，用SDS法提取的DNA得率普遍較高，但是A260/A280比值多低于1.8，說明提取的DNA樣品中存在蛋白質(zhì)或多酚污染；用改良CTAB法提取的DNA得率較低，但A260/A280比值在1.8左右，說明DNA的純度較高。如圖1所示，用SDS法提取的DNA點(diǎn)樣孔能看到明顯的亮光，說明樣品中含有未去除的蛋白質(zhì)。

在提取過程中，用改良CTAB法提取的DNA顏色呈乳白至透明狀，但用SDS法提取的DNA顏色普遍較深，呈棕色至深棕色，可能是甘西鼠尾草中酚類及糖類雜質(zhì)未被除盡。綜合考慮，雖然CTAB法比SDS法提取的DNA得率低，但是高純度的DNA才是本實(shí)驗(yàn)的目的，因此在這兩種方法中，改良CTAB法是較為理想的提取方法，其它提取方法的發(fā)掘，還有待進(jìn)一步研究。

[1] 翁裕馨，李成義.中藏藥材甘西鼠尾草的研究進(jìn)展[J].中國民族民間醫(yī)藥，2010,19(3):19.

[2] JIAN YH.Special Study on Plants of Radix Salviae Miltiorrhizae Variety Sort and Qulity Control of Common Chinese Medicinal Materials[M].Fuzhou: Fujian Science and Technology Publishing House, 1994.

[3] 楊立新，李杏翠，劉超燈，等.甘西鼠尾草中化學(xué)成分研究[J].藥學(xué)學(xué)報，2011,46(7)：818.

[4] 王利彥，王津慧，呂慧玲，等.甘西鼠尾草的抗缺氧研究[J].四川中醫(yī)，2009,27(4)：43.

[5] 李旻輝，宋曉玲,肖培根，等. 中國鼠尾草屬植物傳統(tǒng)藥物學(xué)的調(diào)查[J].時珍國醫(yī)國藥，2011,22(2)：476.

[6] 黃璐琦.分子生藥學(xué)[M].北京：北京醫(yī)科大學(xué)出版社，2006.

(責(zé)任編輯：魏 曉)

Comparative Study of Methods for Isolation of Total DNA from Tibetan Medicine Jizi-Enbao(SalviaPrzewalskiiMaxim.)

Li Wenyuan，Wang Jinhui，Tong Li，Yang Jing，Rezeng-Caidan，Suonan-Dengdeng，Yang Fang

(Medical College of Qinghai University, Xining 810001，China)

Objective:To obtain a method for yielding DNA from tibetan medicine Jizi-Enbao(Salvia przewalskii Maxim.), which lie a foundation for further molecular experiments.Methods:Two different DNA extraction protocols, SDS protocol, and the improved CTAB protocol, were examined and compared. The purity and concentration of DNA were detected by UV spectrophotometric analysising and agarose gel electrophoresis testing.Results and Conclusion:The DNA isolated by improved CTAB protocol was with high quality in two different DNA extraction protocols.

Jizi-Enbao;SalviaprzewalskiiMaxim; DNA extraction

2014-11-14

青海省科技廳項目(2011-N-F19)；青海大學(xué)中青年科研基金(2012-QYT-1)

李文淵(1983-)，女，碩士，青海大學(xué)講師，研究方向?yàn)橹胁厮庂Y源研究。

R285.5

A

1673-2197(2015)07-0011-02

10.11954/ytctyy.201507005