姜 鴻，鄒桂欣，王光涵，邸子真，尤獻(xiàn)民

(遼寧省中醫(yī)藥研究院，遼寧 沈陽 110034)

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基于5-LOX體外代謝途徑的火絨草抗炎活性部位篩選

姜 鴻，鄒桂欣，王光涵，邸子真，尤獻(xiàn)民*

(遼寧省中醫(yī)藥研究院，遼寧 沈陽 110034)

目的：篩選火絨草中的抗炎活性部位。方法：采用系統(tǒng)溶劑法按照極性由低到高的順序分離得到火絨草石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇萃取物、水提取物。采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)建立花生四烯酸(AA)的5-脂氧合酶(5-LOX)體外代謝途徑，檢測火絨草提取物抑制5-LOX活性的能力。結(jié)果：火絨草乙酸乙酯提取物對(duì)5-LOX活性有76.92%強(qiáng)度的抑制作用。結(jié)論：火絨草乙酸乙酯提取物具有較強(qiáng)的抗炎活性，可作為潛在的抗炎活性成分篩選藥物。

火絨草；抗炎；酶聯(lián)免疫法；花生四烯酸；脂氧合酶

火絨草(Leontopodiumleontopodioides(Willd.)Beauv為菊科火絨草屬植物的干燥全草，其味微苦，性寒，入腎、膀胱二經(jīng)，具有清熱涼血、消炎利尿的功效。火絨草常用于治療炎癥性疾病，對(duì)于流行性感冒、急慢性腎炎、尿路感染、尿血、創(chuàng)傷出血等菌有一定的治療效果。目前關(guān)于火絨草的文獻(xiàn)報(bào)道較多，但對(duì)其活性部位的篩選研究尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。

炎癥引發(fā)的疾病是人類常見的免疫系統(tǒng)疾病，醫(yī)藥市場對(duì)抗炎藥物的需求量極大。藥理學(xué)研究表明，花生四烯酸(arachidonic acid，AA)，即5,8,11,14二十碳四烯酸，是生物體內(nèi)必需的一種不飽和脂肪酸，在炎癥發(fā)生過程中起著重要作用。在正常生理狀態(tài)下，AA在生物體內(nèi)主要以磷脂的形式存在于細(xì)胞膜上，當(dāng)細(xì)胞膜受到各種刺激，特別是炎癥反應(yīng)發(fā)生時(shí)，在磷脂酶A(phospholipase A2，PLA2)和磷脂酶C(phospholipase C，PLC)的催化下，磷脂從細(xì)胞膜的磷脂池中釋放出來，并在花生四烯酸代謝酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂猩锘钚缘拇x產(chǎn)物，進(jìn)而發(fā)生花生四烯酸的炎癥級(jí)聯(lián)代謝。目前研究表明，至少有環(huán)氧化酶(cycloxygenase，COX)、脂氧合酶(1ipoxygenase，LOX)和細(xì)胞素P450(cytochrome P450，CYP450)三類酶參與了AA代謝途徑，主要的代謝通路為COX和LOX。LOX通路中至少有5-LOX、12-LOX和15-LOX 三種酶參與了AA代謝。其中，5-LOX在激活蛋白(5-FLAP)的協(xié)助下催化AA轉(zhuǎn)化生成白三烯(1eukotrienes，LTs) 、脂質(zhì)過氧化物，如在中性粒細(xì)胞和其他炎癥細(xì)胞中，LTA4由環(huán)氧化物水解酶(LTA4H)催化生成LTB4；LTA4與谷胱甘肽結(jié)合轉(zhuǎn)化為LTC4，而LTC4轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外并裂解形成LTD4和LTE4。形成白三烯的5-LOX通路在前炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中起到重要作用，其中5-LOX、LTs、脂質(zhì)過氧化物等分別是抗炎藥物設(shè)計(jì)的重點(diǎn)靶標(biāo)。

本研究采用酶聯(lián)免疫法(Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay,ELISA)，借助AA的LOX體外生化代謝途徑，篩選火絨草的抗炎活性部位，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試劑

1.1 藥品

火絨草藥材提取物，由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試劑

Tris-HCl(Trizma Pre-set crystals pH7.0-biotechn,Lot No:11M5401)，5-LOX(Lipoxidase Type V from soybean,Lot No:91K7026V)，AA (Arachidnic ACID free ACID from porcine,Lot No:31M1213V)，HRP(Peroxidase Type VI-1 from horseradish*PA,Lot No:90M77151V)，以上試劑均購自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；TMPD(N,N,N’,N’-Tetramethy-p-phenylenediamine dihydrochloride，Johnson Matthey Company,Lot No:10119382)；二甲基亞砜(DMSO，色譜級(jí))，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 儀器

Biotek酶聯(lián)免疫檢測儀(Elx800型，美國伯騰儀器有限公司)；DHZ-D冷凍恒溫震蕩器(江蘇太倉市試驗(yàn)設(shè)備廠)；QL-901漩渦振蕩器(江蘇海門麒麟儀器廠)；96孔板(美國Comning公司)。

2 方法

2.1 提取物制備

取火絨草藥材適量，加水提取，量取1/2提取液，減壓干燥至干，稱定重量，粉碎成細(xì)粉，作為Ⅰ號(hào)提取物(火絨草藥材提取液)；剩余提取液置于分液漏斗中，分別用石油醚、醋酸乙酯、水飽和正丁醇各萃取5次，分別合并各自萃取溶液，回收溶劑，減壓干燥至干，稱定重量，粉碎成細(xì)粉，分別作為Ⅱ號(hào)提取物(石油醚層)、Ⅲ號(hào)提取物(醋酸乙酯層)、Ⅳ號(hào)提取物(正丁醇層)。取經(jīng)過上述溶劑萃取后的水溶液，濃縮并減壓干燥至干，稱定重量，粉碎成細(xì)粉，作為Ⅴ號(hào)提取物(剩余水層)。

2.2 方法

2.2.1 原理 花生四烯酸(AA)可被脂氧合酶(5-LOX)催化氧化生成5-羥基過氧四烯酸，辣根過氧化酶(HRP)可以5-羥基過氧四烯酸和四甲基對(duì)苯二胺鹽酸(TMPD)為底物生成一種可在610nm處產(chǎn)生吸收的物質(zhì)。

2.2.2 試劑配制 Tris-HCl：0.1mol·L-1，pH7.0；5-LOX：用前將其稀釋至360μL，每次用量10μL，使其終濃度為1μg/孔；AA：采用95%乙醇將原液配置成濃度為21mmol·L-1的儲(chǔ)備液，用時(shí)稀釋30倍，每次用10μL，終濃度為33.33μmol·L-1；HRP：配置13.9mg/mL儲(chǔ)備液，置于低溫下保存，用時(shí)稀釋20倍；TMPD：配制成28mg/mL儲(chǔ)備液，置于低溫下保存，用時(shí)蒸餾水稀釋10倍。樣品制備：將提取物溶解于DMSO中，制備成含200mg/mL生藥的儲(chǔ)備液。

2.2.3 操作步驟 ①空白：180μL Tris-HCl、10μLHPR；②控制池：170μL Tris-HCl、10μL 5-LOX、10μLHPR；③N：160μL Tris-HCl、10μL待測藥物、10μL 5-LOX、10μLHPR；④小心振搖酶標(biāo)板使溶液混勻，37℃孵育10min；⑤每個(gè)池加入10μL TMPD，再加入10μL花生四烯酸以激活反應(yīng)，小心振搖酶標(biāo)板數(shù)秒鐘使溶液混勻，在25℃下孵育15min。采用酶標(biāo)儀于610nm波長處測定吸光度，以上試驗(yàn)重復(fù)操作5次，計(jì)算吸光度平均值。

3 結(jié)果

從表1結(jié)果可以看出，Ⅲ號(hào)提取物抑制了76.92% 5-LOX的活性，為5個(gè)提取物中5-LOX活性抑制作用最強(qiáng)的，其次為Ⅰ號(hào)提取物(57.69%)和Ⅳ號(hào)提取物(43.85%)，Ⅱ號(hào)提取物對(duì)5-LOX的抑制作用很弱(15.38%)，Ⅴ號(hào)提取物對(duì)5-LOX幾乎沒有抑制作用。由此可知，火絨草中具有抗炎作用的部位主要為Ⅲ號(hào)提取物，即乙酸乙酯提取物；Ⅰ號(hào)提取物(火絨草藥材提取液)的抗炎作用次于Ⅲ號(hào)提取物，可能是由于Ⅰ號(hào)提取物是火絨草藥材原提取液，所含成分復(fù)雜，一些雜質(zhì)成分干擾活性成分的抗炎效果；Ⅳ號(hào)提取物，即正丁醇提取物，也有一定的抗炎作用，僅次于Ⅰ號(hào)提取物，說明Ⅳ號(hào)提取物中也可能含有一些具有抗炎活性的成分，或者這些成分是和Ⅲ號(hào)提取物共有的?；谝陨辖Y(jié)果，筆者將進(jìn)一步對(duì)Ⅲ號(hào)、Ⅳ號(hào)提取物進(jìn)行研究，尋找火絨草藥材中具有抗炎活性的單體化合物。

表1 樣品吸收度及相對(duì)酶活力 ±s)

4 討論

4.1 DMSO對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

由于火絨草提取物中含有脂溶性和水溶性兩種成分，為使提取物完全溶解，故采用DMSO作為溶媒，并分別配制含有不同濃度的DMSO緩沖液，按相同的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，DMSO濃度對(duì)測定結(jié)果的影響很小，各組間比較無顯著差異，但為使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加科學(xué)、真實(shí)，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)使DMSO濃度保持一致。

4.2 測定時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

TMPD易被氧化，其水溶液在空氣中就可被緩慢氧化成藍(lán)色，藍(lán)色的深淺程度與所檢測的酶活性具有良好的線性關(guān)系，因此可用于檢測抑制劑的活性。但空氣中也可能含有具有一定氧化能力的物質(zhì)，因此確定最佳測定時(shí)間點(diǎn)為本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。本研究按照上述測定方法，在0～60min內(nèi)動(dòng)態(tài)考察樣品與純TMPD吸收度在不同時(shí)間段的比值，以此確定其最終測定時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在15min時(shí)兩者的比值最大，因此確定最佳測定時(shí)間為15min。

4.3 測定樣品終濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響

測定樣品終濃度對(duì)測定結(jié)果影響很大，當(dāng)樣品溶液終濃度過高時(shí)，反應(yīng)體系顏色明顯變淺，但吸光度值很大，甚至超過控制池的限值，會(huì)造成樣品幾乎沒有抑制5-LOX活性作用的假象，且每次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性很差。通過對(duì)樣品系列濃度考察發(fā)現(xiàn)，以提取物中對(duì)5-LOX活性抑制作用最強(qiáng)的Ⅲ號(hào)提取物為準(zhǔn)，樣品最佳終濃度為200mg/mL，每次加10μL，測定結(jié)果重復(fù)性較好，5個(gè)提取物的變異系數(shù)在1.06%～1.82%之間(n=5)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

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(責(zé)任編輯：尹晨茹)

Leontopodium Anti-inflammatory Active Site Selection Based on 5-LOX in Vitro Metabolic Pathways

Jiang Hong,Zou Guixin,Wang Guanghan,Di Zizhen,You Xianmin*

(Medical Research Institute of Liaoning Province,Shenyang 110034,China)

Objective:To filtrate anti-inflammatory active site of leontopodium.Methods:The system solvent method is adopted according to the polarity from low to high,the leontopodium petroleum ether extract and ethyl acetate extract,n-butanol extract and water extract was isolated.Using ELISA,to establish the AA of 5-LOX in vitro metabolic pathways,detect leontopodium extracts inhibit the ability of 5-LOX activity.Results:The Ethyl acetate extract of leontopodium inhibits the 76.92% activity of 5-LOX.Conclusion:The ethyl acetate extract of the leontopodium has strong anti-inflammatory activity.

Leontopodium；Anti-inflammation；ELISA;Arachidonic Acid；Lipoxygenase

2014-10-29

國家科技重大專項(xiàng)：中藥新藥臨床評(píng)價(jià)研究技術(shù)平臺(tái)(2012ZX09303-017-001)

姜鴻(1975-)，男，遼寧省中醫(yī)藥研究院副研究員，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)及中藥新藥研發(fā)。E-mail：jh0723@126.com

尤獻(xiàn)民(1964-)，男，遼寧省中醫(yī)藥研究院研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樗幬锓治黾爸兴幮滤幯邪l(fā)。E-mail：youxianmin1120@126.com

R285.5

A

1673-2197(2015)06-0036-02

10.11954/ytctyy.201506016