萬(wàn) 露，閔紅燕，肖云芝，張文騫，申寶德，韓 晉*，袁海龍*

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330000；2.中國(guó)人民解放軍第三〇二醫(yī)院，北京 100039；3.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137)

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正交設(shè)計(jì)多指標(biāo)綜合評(píng)分優(yōu)化鱉甲微波滅菌工藝

萬(wàn) 露1,2，閔紅燕1，肖云芝3，張文騫2，申寶德2，韓 晉2*，袁海龍2*

(1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330000；2.中國(guó)人民解放軍第三〇二醫(yī)院，北京 100039；3.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都 611137)

目的：優(yōu)選鱉甲的微波滅菌工藝。方法：以藥材含濕率、滅菌時(shí)間、滅菌功率為考察因素，以滅菌率和鱉甲抗肝纖維化作用(人肝星狀細(xì)胞LX-2生長(zhǎng)抑制率)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交設(shè)計(jì)多指標(biāo)綜合評(píng)分法優(yōu)化微波滅菌鱉甲的工藝參數(shù)。結(jié)果：最佳微波滅菌工藝參數(shù)：滅菌時(shí)間為6min，藥材含濕率為20%，滅菌功率為4 000W。結(jié)論：正交設(shè)計(jì)多指標(biāo)綜合評(píng)分法可用于鱉甲微波滅菌工藝的參數(shù)優(yōu)化，該方法簡(jiǎn)便可行，且滅菌效率高，對(duì)鱉甲抗肝纖維作用無(wú)影響。

鱉甲；微波滅菌；正交設(shè)計(jì)；多指標(biāo)綜合評(píng)分

復(fù)方鱉甲軟肝片是我國(guó)治療慢性肝炎纖維化、早期肝硬化的首選藥[1]，主要由鱉甲、赤芍、當(dāng)歸等11味藥組成，其中鱉甲為原材料粉碎直接入藥。國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局(CFDA)明確規(guī)定：中藥原粉入藥品種必須選擇合適的方式進(jìn)行滅菌[2]，藥材的滅菌工藝是影響制劑質(zhì)量的重要因素。

不當(dāng)?shù)臏缇椒〞?huì)破壞中藥材中的有效成分而降低其療效，也可使藥材產(chǎn)生一些有害物質(zhì)或殘留滅菌介質(zhì)從而損害機(jī)體，也可導(dǎo)致活性成分遷移。因此以原粉入藥的中藥的滅菌方法與一般藥材不同，應(yīng)有嚴(yán)格的工藝要求。常用中藥滅菌方法包括濕熱滅菌、紫外線滅菌、環(huán)氧乙烷滅菌法、濾過(guò)除菌、臭氧滅菌、干熱滅菌法、Co60輻射滅菌等，但均存在一定不足[3]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，微波滅菌技術(shù)具有良好的滅菌效果，其穿透力強(qiáng)、時(shí)間短、效率高，對(duì)藥材的成分不造成影響[4-5]。CFDA在進(jìn)行中藥新藥審評(píng)時(shí)[6]，對(duì)微波滅菌技術(shù)的效果給予了肯定，認(rèn)為其是理想的中藥材滅菌方法。

本研究采用微波滅菌法處理復(fù)方鱉甲軟肝片中以原粉入藥的鱉甲，為避免單一指標(biāo)進(jìn)行工藝優(yōu)化時(shí)產(chǎn)生偏差且兼顧微波滅菌的效果與藥材質(zhì)量，擬以滅菌率和肝星狀細(xì)胞LX-2的生長(zhǎng)抑制率為考察指標(biāo)，采用正交設(shè)計(jì)多指標(biāo)綜合評(píng)分法優(yōu)化微波滅菌工藝，篩選最佳滅菌工藝，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器

YHD-4HMY型微波殺菌機(jī)(北京億慧達(dá)微波設(shè)備有限公司，工作頻率為2 450MHz，微波功率最大可調(diào)6 000W)；BAS-124S電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；XDS-1B倒置生物顯微鏡(北京京瑞天下科技有限公司)；Forma Series II水套CO2培養(yǎng)箱(Thermo Fisher)；Multiskan GO全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Thermo Scientific)。

1.2 試藥

鱉甲藥材(中國(guó)人民解放軍第三〇二醫(yī)院提供，經(jīng)中國(guó)人民解放軍第三〇二醫(yī)院袁海龍研究員鑒定為鱉甲)；pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司，批號(hào)：140306)；細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司，批號(hào)：140212)；霉菌玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司，批號(hào)：140228)；水為重蒸水，其他試劑均為分析純。

胎牛血清(美國(guó)HyClone公司，批號(hào)：DPEO167)；二苯基四氮唑藍(lán)(MTT，批號(hào)：1325B38)、二甲基亞砜(DMSO，批號(hào)：20130505324)均購(gòu)自美國(guó)Amresco公司；LX-2肝星狀細(xì)胞(北京協(xié)和細(xì)胞資源中心)。

2 方法與結(jié)果

2.1 因素水平確定

在微波干燥滅菌的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)和前期單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取滅菌功率(A)、滅菌時(shí)間(B)和藥材含濕度(C)為考察因素，每個(gè)因素設(shè)定3個(gè)水平，具體因素水平見(jiàn)表1。

表1 鱉甲微波滅菌工藝正交實(shí)驗(yàn)因素水平

2.2 藥材處理

稱取粉碎的鱉甲3份，每份0.20kg，分別以10%、20%、30%純化水拌潤(rùn)均勻，取樣，檢測(cè)細(xì)菌數(shù)。按照L9(34)正交表安排試驗(yàn)，微波真空干燥箱溫度設(shè)定為60℃，潤(rùn)濕鱉甲藥材后以一定的厚度(1～3cm)均勻平鋪于微波真空干燥箱內(nèi)部托盤(pán)上，按照預(yù)定的滅菌功率和時(shí)間對(duì)鱉甲進(jìn)行滅菌處理，滅菌結(jié)束后，立即將藥材裝入已滅菌的容器中備用。

2.3 微生物限度檢查[8]

參照《中國(guó)藥典》2010 年版一部附錄ⅩⅢ中的微生物限度檢查法，取滅菌前后藥材各10g，加pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液溶解至100mL，作為1∶10供試液。取1∶10供試液1mL加0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液至10mL，作為1∶100供試液。采用稀釋法(0.5mL/皿)檢查(附錄ⅩⅢ C)細(xì)菌數(shù)，采用常規(guī)法檢查酵母菌數(shù)，采用常規(guī)法檢查控制菌數(shù)。

滅菌率(%)=(滅菌前細(xì)菌數(shù)-滅菌后細(xì)菌數(shù))/滅菌前細(xì)菌數(shù)×100%。

2.4 MTT法測(cè)定鱉甲抗纖維化作用

2.4.1 細(xì)胞系及其培養(yǎng)條件 LX-2肝星狀細(xì)胞系在含有20%胎牛血清、1.0×103U/L青霉素、100mg/L鏈霉素以及必需氨基酸和葡萄糖等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2環(huán)境下進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)均在細(xì)胞生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期時(shí)進(jìn)行。

2.4.2 供試品溶液配制 精密稱取滅菌前及不同滅菌條件下處理的鱉甲各5g，分別置于50mL具塞錐形瓶中，加75%乙醇25mL，稱重，超聲提取60min，取出放冷后再稱重，補(bǔ)足減少的重量，搖勻，離心10min(7 000r/min)。提取液過(guò)0.45μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，冷凍干燥，供抗肝纖維化試驗(yàn)使用。

2.4.3 鱉甲藥材提取液細(xì)胞抑制率測(cè)定 前期實(shí)驗(yàn)[8]確定了樣品最佳添加量為35%濃度。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期LX-2肝星狀細(xì)胞，采用胰酶常規(guī)消化成單細(xì)胞懸液，接種至96孔板中(每孔約5×104細(xì)胞)，孔板四周以無(wú)菌PBS填充以防止邊緣效應(yīng)。細(xì)胞置于96孔板中貼壁24h后(每孔200μL)[9]，將其分成10組分別給予35%濃度滅菌前鱉甲藥粉溶液、滅菌后鱉甲藥粉溶液(含0.1%DMSO的培養(yǎng)基溶液)，并設(shè)置8個(gè)空白對(duì)照孔(加入含相應(yīng)濃度生理鹽水的DMEM培養(yǎng)基)和8個(gè)調(diào)零孔，細(xì)胞在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48h后，加入5mg/mL MTT溶液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，小心吸取培養(yǎng)液，每孔加入DMSO溶液200μL，搖床低速振蕩10min后，采用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔在490nm處的吸光度值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

抑制率=(A0-A1) / A0，其中A0為陰性對(duì)照組吸光度值，A1為藥物組吸光度值。

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果

按照L9(34)正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行試驗(yàn)，分別測(cè)定各條件下的滅菌率和細(xì)胞抑制率。

采用綜合加權(quán)評(píng)分法[10-11]，結(jié)合該工藝的特點(diǎn)和相關(guān)文獻(xiàn)，權(quán)衡各指標(biāo)對(duì)處方的影響，設(shè)定指標(biāo)滅菌率(X/%)和 細(xì)胞抑制率(Y/%)的權(quán)重系數(shù)分別為0.6、0.4 ，根據(jù)各指標(biāo)的權(quán)重，計(jì)算多屬性綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析，綜合評(píng)分=0.6X/98.1+0.4Y/50.97，結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

直觀分析表明，以綜合評(píng)分為標(biāo)準(zhǔn)，在所選因素水平范圍內(nèi)，各因素作用主次順序?yàn)锽>C>A，方差分析表明，B(滅菌時(shí)間)為主要影響因素，具有顯著性(P<0.05)，最終確定最佳提取工藝為A2B2C2，即滅菌功率為4 000W，滅菌時(shí)間為6min，藥材含濕率為20%。

2.6 最佳工藝條件驗(yàn)證

按照最佳工藝條件滅菌3批鱉甲藥材，測(cè)得鱉甲中各指標(biāo)成分含量，并計(jì)算綜合評(píng)分，結(jié)果見(jiàn)表4，與預(yù)測(cè)值接近，其RSD為0.863%。鱉甲中霉菌及酵母菌數(shù)每1g<100cfu，微生物控制菌，包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌均未檢出，證明該方法穩(wěn)定可行。

表2 微波滅菌工藝L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 鱉甲微波滅菌工藝正交試驗(yàn)方差分析

表4 鱉甲最佳微波滅菌工藝驗(yàn)證結(jié)果 (%)

3 討論

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，微波的穿透深度為 3～5cm[14]，本研究亦表明，當(dāng)藥材平鋪厚度為1～3cm時(shí)，粉碎粒徑大小對(duì)其滅菌效果影響不大，說(shuō)明微波可穿透至介質(zhì)和藥材的深部，可使藥材表里一致的均勻受熱，且滅菌時(shí)間越長(zhǎng)，滅菌率越高。由于鱉甲中的活性成分為蛋白質(zhì)及多肽類，其分子結(jié)構(gòu)特殊，溫度的升高可導(dǎo)致多肽主鏈氨基酸降解以及側(cè)鏈氨基酸殘基變化[15]，大大影響藥材質(zhì)量。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇對(duì)微波滅菌效果影響最大的三個(gè)因素進(jìn)行考察，篩選出符合實(shí)際工藝的兩個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)，以滅菌率評(píng)價(jià)滅菌效果，以人肝星狀細(xì)胞LX-2生長(zhǎng)抑制率評(píng)價(jià)鱉甲抗肝纖維化作用。本研究采用多指標(biāo)綜合加權(quán)評(píng)分法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，較單一指標(biāo)更為科學(xué)，且對(duì)各指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行必要的標(biāo)準(zhǔn)化處理，保證了評(píng)價(jià)指標(biāo)的全面性，使滅菌工藝的優(yōu)化更為合理。

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(責(zé)任編輯：尹晨茹)

Optimization of the Microwave Sterilization Technology of Carapax Trionycis by Orthogonal Design with Multi-index Comprehensive Evaluation Method

Wan Lu1,2,Min Hongyan1,Xiao Yunzhi3,Zhang Wenqian2,Sheng Baode2,Han Jin2*,Yuan Hailong2*

(1.Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine,Jiangxi 330000,China;2.302 Military Hospital of China,Beijing 100039,China；3.Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 611137,China)

Objective:To optimize the microwave sterilization technology of Carapax Trionycis.Methods:Orthogonal design was carried out to achieve the best microwave sterilization technology of C.Trionycis by the multi-index comprehensive evaluation method with herbs moisture content,sterilization time and microwave power as investigation factors,and sterilization rate and anti-hepatic fibrosis efficacy (the LX-2 hepatic stellate cell proliferation inhibition rate) as indexes.Results:The best sterilization technology was as follows: herbs moisture content 20%,sterilization time 6 min and microwave power 4 000W.Conclusion:It is simple and feasible that using orthogonal design with multi-index comprehensive evaluation method to optimize the microwave sterilization technology of C.Trionycis.This method not only has high sterilization efficiency,but also has no effect on C.Trionycis anti-hepatic fibrosis efficacy.

Carapax Trionycis;Microwave Sterilization;Orthogonal Design;Multi-index Comprehensive Evaluation

2014-10-11

國(guó)家新藥創(chuàng)制重大專項(xiàng)(2011ZX09201-201-14)；軍隊(duì)醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑標(biāo)準(zhǔn)提高科研專項(xiàng)(13ZJZ12，13ZJZ12-5)

萬(wàn)露(1989- )，女，江西中醫(yī)藥大學(xué)碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幮轮苿?、新劑型、新技術(shù)。

袁海龍，男，博士，中國(guó)人民解放軍第三〇二醫(yī)院研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幮滦徒o藥系統(tǒng)。E-mail: yhlpharm@126.com；韓晉，女，中國(guó)人民解放軍第三〇二醫(yī)院主任藥師，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴巹┬团c工程技術(shù)。E-mail: hanjin302emba@163.com

R284;R954

A

1673-2197(2015)06-0026-03

10.11954/ytctyy.201506011