宋雯舒，劉順會*，陳天宇，徐曉鵬

(1.廣東藥學院 生命科學與生物制藥學院，廣東 廣州 510006;2.中山大學 生命科學學院，廣東 廣州 510275)

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地龍復方止咳、祛痰、平喘藥效學研究

宋雯舒1，劉順會1*，陳天宇1，徐曉鵬2

(1.廣東藥學院 生命科學與生物制藥學院，廣東 廣州 510006;2.中山大學 生命科學學院，廣東 廣州 510275)

目的：研究地龍復方的止咳、祛痰、平喘作用。方法：分別采用氨水引咳小鼠模型和小鼠酚紅排泄試驗考察地龍復方的止咳、祛痰作用；采用卵蛋白(OVA)致敏的過敏性哮喘小鼠肺泡灌洗液(BALF)進行細胞分類計數(shù)分析，以及支氣管及血管周圍炎性細胞浸潤評分、肺泡灌洗液(BALF)及血清中白介素-4(IL-4)的ELISA分析綜合研究其平喘作用。結(jié)果：地龍復方能顯著延長小鼠咳嗽潛伏期，減少咳嗽次數(shù)，增加支氣管黏液分泌量，同時能抑制BALF中炎性細胞數(shù)增多，減輕小鼠支氣管及血管周圍的炎性浸潤程度，減少BALF及血清中炎性因子IL-4含量。結(jié)論：地龍復方能有效減輕氣道炎癥，并具有一定的止咳、祛痰和平喘效果。

地龍復方；藥效學；炙麻黃；甘草；止咳；祛痰；平喘

哮喘是由氣道炎性細胞和結(jié)構(gòu)細胞(如嗜酸粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞、平滑肌細胞、氣道上皮細胞等)及細胞組分(cellular elements)參與的氣道慢性炎癥性疾病[1]。古代醫(yī)家多認為其病因為痰飲內(nèi)伏、氣因痰阻，而致肺氣宣降失常[2]。目前西醫(yī)臨床常規(guī)選用吸入性皮質(zhì)類激素(ICS)治療哮喘，但長期使用吸入性皮質(zhì)類激素可能會導致兒童和成人嚴重骨流失[3]。因此，開發(fā)出新型安全有效的平喘藥物是解決該類問題的重點。地龍是中醫(yī)治療哮喘的常用藥，在很多治療哮喘的方劑中，如五味地龍湯、地龍細辛湯等都含有地龍成分，實踐證實其具有較好的平喘作用。筆者經(jīng)過前期實驗證實地龍干粉具有良好的平喘止痙效果[4]，但單獨使用地龍的抗炎、祛痰、止咳等效果不佳。地龍和麻黃為常用藥對，兩藥同用，功擅宣肺平喘，適用于痰濁阻塞氣道之哮喘病的治療。褚襄萍等[5]研究表明地龍和麻黃以3∶1比例使用時對離體平滑肌收縮有較好的抑制作用?！督饏T要略》《傷寒論》等古籍中均表明麻黃和甘草配伍用藥具有一定的利水消腫作用，且現(xiàn)代研究[6]表明麻黃和甘草以2∶1比例配伍使用時有較好的抗炎作用。基于前期研究和文獻調(diào)研，參考中醫(yī)藥配伍理論，初步擬定地龍復方由地龍、炙麻黃、甘草三味藥物組成，比例為6∶2∶1，其中地龍通絡平喘，蜜麻黃潤肺止咳，甘草補氣益中、祛痰止咳并調(diào)和藥性。本實驗通過比較地龍單方與復方在止咳、祛痰及對哮喘小鼠氣道炎癥方面的作用，考察地龍復方在抗哮喘方面的作用效果，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試劑

1.1 動物

昆明小鼠，6周齡，體重18～22g，雌雄兼用，購自廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心，許可證號為SCXK(粵)2013-0020；SPF級雌性Balb/c小鼠，45只，6周齡，體重18～22g，購自中山大學實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號SCXK(粵)2011-0029。

1.2 藥物

炙麻黃、甘草購自廣州采芝林藥業(yè)，地龍為赤子愛勝蚓(Eisenia Foetida)鮮品，由本實驗室提供；地塞米松(0.75mg/片，廣東華南藥業(yè)集團有限公司，批號：130201)；咳特靈片(廣州白云山制藥總廠，批號：1120444)。

1.3 試劑

酚紅(sigma分裝)、氨水(天津市百世紅有限公司)、碳酸氫鈉(成都科龍化工試劑廠)、卵蛋白OVA(sigma公司)、蘇木素-伊紅(HE)染液試劑盒(南京建成研究所)、小鼠白介素-4ELISA試劑盒(博士德生物)。

1.4 實驗儀器

WH-2000超聲波霧化器(廣東粵華醫(yī)療器械有限公司)；759紫外-可見分光光度計(上海菁華科技有限公司)；EG1160型石蠟包埋機(LEICA公司，德國)；RM2255切片機、TEC-2500病理組織漂烘儀(LEICA公司，德國)；Bioquant-Osteo骨形態(tài)學圖像分析系統(tǒng)(BIOQUAN，USA)；標準酶標儀(Thermo公司)。

2 方法

2.1 試藥處理

地龍干燥全粉：取鮮地龍200g，洗凈，吐泥24h后，用55℃水燙死，置于55℃恒溫烘箱中烘干，得干燥地龍(產(chǎn)率為17.7%)，采用超微粉碎機磨成細粉，得地龍干燥全粉。

炙麻黃甘草濃縮液：取10g炙麻黃、5g甘草分別用100mL和50mL水浸泡過夜，先將炙麻黃煎煮15min，再與甘草混合繼續(xù)煎煮15min，過濾，濾渣再加150mL水煎煮，重復2次，每次30min，合并3次煎煮液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至200mL，得炙麻黃甘草濃縮液(相當于生藥濃度0.05g/mL)。

2.2 各組動物給藥劑量(見表1)2.3 鎮(zhèn)咳實驗(濃氨水引咳法)[7-8]

昆明種小鼠，體重18～22g，40只，雌雄各半，隨機分為5組，即空白對照組(Nor)、地龍組(DL)、炙麻黃甘草提取液組(MG)、地龍復方組(DF)、咳特靈片組(KL)。將小鼠置于1 000mL燒杯中，采用超聲波霧化器，以0.5mL/min的速度將濃氨水噴入燒杯內(nèi)，持續(xù)噴霧15s，通入濃氨水時開始觀察和記錄小鼠的咳嗽潛伏期和3min內(nèi)咳嗽次數(shù)，剔除噴霧3min內(nèi)咳嗽次數(shù)少于10次及多于80次的小鼠。按照表1中的劑量給藥，連續(xù)灌胃給藥5天后，重復上述實驗，記錄各組小鼠的咳嗽潛伏期(小鼠發(fā)生第一次咳嗽反射的時間)和3min內(nèi)的咳嗽次數(shù)。

表1 各組動物給藥劑量

注：Nor：空白對照組；DL：地龍組；MG：炙麻黃甘草提取液組；DF：地龍復方組；KL：咳特靈片組。

2.4 小鼠祛痰實驗(小鼠酚紅排泌法)[9]

昆明種小鼠，體重18～22g，40只，雌雄各半，分組方法同鎮(zhèn)咳實驗，給藥量亦相同，各組小鼠連續(xù)給藥5天后，末次給藥1.5h后腹腔注射1%酚紅生理鹽水，30min后眼球放血處死小鼠，剪開頸部皮膚，分離氣管，在氣管甲狀軟骨下端行氣管插管并與注射器相連，用0.8mL 5%NaHCO3溶液緩慢注入氣管，然后輕輕吸出，反復灌洗3次，合并灌洗液，1 500r/min離心，取上清，采用分光光度計在545nm波長處檢測吸收度(A值)，制備酚紅標準曲線，根據(jù)酚紅標準曲線計算酚紅濃度(C)。

2.5 小鼠平喘實驗

2.5.1 過敏性哮喘模型建立[10-11]取Balb/c小鼠48只，隨機分為6組，即空白對照組(Nor)、過敏性哮喘模型組(M)、陽性藥物(地塞米松)組(DM)、地龍組(DL)、炙麻黃甘草提取液組(MG)、地龍復方組(DF)，每組8只，正常飼養(yǎng)7天后，除Nor組小鼠腹腔注射0.2mL pH7.4 的PBS溶液外，其余各組小鼠均于第1、7、14天腹腔注射pH7.4的PBS溶液0.2mL(含有20μg OVA，2mg AL(OH)3凝膠)致敏，從第21天起，除Nor組小鼠單獨用等量的pH7.4 PBS霧化外，其余各組小鼠均采用2.5%OVA溶液霧化激發(fā)(1.5mL/min，30min/次，3次/周，連續(xù)3周)。

2.5.2 給藥劑量 Nor組、M組：1mL/kg pH7.4 PBS，其余各組按照表1中劑量給藥。

2.5.3 肺泡灌洗液(BALF)分類計數(shù) 于最后一次霧化激發(fā)24h內(nèi)，放血處死小鼠，收集血液，氣管插管后采用0.8mL PBS進行肺泡灌洗，重復3次，合并3次BALF，3 000r/min離心10min，收集上清液，沉淀加1mL PBS重懸。采用血球計數(shù)板計白細胞總數(shù)，取200μL涂片瑞士-吉姆薩染色后進行分類計數(shù)，計200個細胞，取下左肺，保存于福爾馬林溶液中。

2.5.4 氣管及血管周圍炎性浸潤計分 左肺于福爾馬林中固定24h后，脫水、浸蠟、石蠟包埋、4μm切片后，脫蠟至水，按照試劑盒說明進行HE染色，顯微鏡下對支氣管進行炎性計分。計分標準為：0分：幾乎沒有炎性細胞；1分：存在少量炎性細胞；2分：存在一層炎性細胞；3分：存在2～4層炎性細胞；4分：存在4層以上炎性細胞，每個肺部組織至少計10根支氣管，直徑在10μm左右[12]。

2.5.5 BALF及血清中IL-4含量測定 將血清及BALF樣本平衡至室溫，按照試劑盒說明進行測定。

2.6 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 鎮(zhèn)咳作用

各給藥組小鼠咳嗽潛伏期均有不同程度的延長，與陰性對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與地龍組、炙麻黃甘草提取液組比較，地龍復方組小鼠咳嗽潛伏期明顯延長，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但與咳特靈組小鼠比較差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。炙麻黃甘草提取液組、地龍組小鼠咳嗽次數(shù)與陰性對照組比較差異顯著，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，兩組之間比較并無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。詳見表2。

表2 地龍復方對小鼠咳嗽潛伏期和咳嗽次數(shù)的影響 ±s)

注：與空白對照組比較，①P<0.05；與地龍復方組比較，②P<0.05。

3.2 祛痰作用

各給藥組小鼠氣道酚紅排泌量均有不同程度的增加。與陰性對照組比較，地龍組小鼠酚紅排泌量增加效果不明顯，差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)；炙麻黃甘草提取液組、地龍復方組和咳特靈組小鼠酚紅排泌量增加效果較為明顯，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與地龍復方組比較，地龍組小鼠酚紅排泌量較低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；炙麻黃甘草提取液組、咳特靈組小鼠酚紅排泌量比較差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 對小鼠氣道酚紅排泌量的影響 ±s)

注：與空白對照組比較，①P<0.05；與地龍復方組比較，②P<0.05。酚紅標準曲線方程：Y=7.989 69X-0.09 ，r2=0.999 77。

3.3 BALF中細胞分類計數(shù)

各給藥組與模型組小鼠BALF中細胞總數(shù)、嗜酸性粒細胞數(shù)、中性粒細胞數(shù)、淋巴細胞數(shù)均有不同程度的減少，其中地龍復方組和地塞米松組小鼠細胞數(shù)量變化較為明顯，與其他組小鼠比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。地龍復方組和地塞米松組小鼠各細胞分類計數(shù)比較差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 OVA致敏的過敏性哮喘小鼠BALF中細胞分類計數(shù) 個/mL)

注：與模型組比較，①P<0.05；與地塞米松組比較，②P<0.05；與空白對照組比較，③P<0.05。

3.4 血管及支氣管周圍炎性計分

圖1結(jié)果表明，地龍復方組小鼠支血管及支氣管周圍炎性計分與模型組比較差異顯著，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明造模成功。各給藥組小鼠血管及支氣管周圍炎性計分均較模型組有所減輕，其中地塞米松組和地龍復方組小鼠改善最為明顯。地龍復方組小鼠炎性計分與地塞米松組比較差異顯著，具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

3.5 ELISA法測定小鼠血清及BALF中IL-4濃度

各給藥組及空白對照組小鼠血清及BALF中IL-4含量與模型組比較均有不同程度的減少，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與地塞米松組比較，地龍復方組小鼠BALF中IL-4含量較高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但血清中IL-4含量差異不明顯，不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表5。

4 討論

地龍作為中醫(yī)治療哮喘的傳統(tǒng)用藥，無論是復方還是單方入藥都顯示出一定的治療效果。利紅宇等[13]研究表明，蛤粉制廣地龍的止咳、祛痰、平喘效果最好，凈制廣地龍有一定的平喘效果，但止咳、祛痰效果不佳。吳世滿[14]研究發(fā)現(xiàn)給予哮喘大鼠腹腔注射地龍注射液可緩解其支氣管痙攣，降低氣道阻力，改善肺功能。王文英等[15-16]研究表明五味地龍湯水煎液能延長豚鼠的哮喘潛伏期，抑制平滑肌收縮，減少肺溢流量，減輕EOS浸潤抗氣道炎癥。陳根生[17]采用麻桑地龍湯治療小兒哮喘，痊愈38例，好轉(zhuǎn)10例，無效2例，總有效率為96%。

地龍復方在止咳、祛痰、平喘方面均較單獨使用地龍效果顯著。地龍本身具有良好的平喘、止痙效果，麻黃、甘草共煎液可抑制炎癥滲出和炎性細胞吸附和聚集，具有良好的抗炎作用[18]。復方中改麻黃為炙麻黃，因其性溫偏潤，辛散發(fā)汗作用較麻黃緩和，并增強了潤肺止咳之功，以宣肺平喘止咳力勝，麻黃和地龍兩藥同用，其配伍關(guān)系為相反藥對中的升降相反，屬于寒溫并用之法，還可抑制麻黃升高血壓和引起心悸的副作用[19]，同時配合甘草以調(diào)和藥性，改善地龍本身的腥臭之氣。

圖1 血管及支氣管周圍炎性浸潤計分

分組數(shù)量(n)血清中IL-4BALF中IL-4M819.40±3.05②40.48±1.76②③DM89.37±0.96①18.71±2.14①③DL817.02±1.46①②③32.06±4.24①②③MG816.36±1.88①②③27.61±2.14①②③DF811.48±2.60①③23.15±3.68①②③Nor87.96±0.656①9.98±1.42①

注：與模型組比較，①P<0.05；與地塞米松組比較，②P<0.05；與空白對照組比較，③P<0.05。

本實驗研究結(jié)果表明，地龍復方在止咳、祛痰方面能顯著延長小鼠咳嗽潛伏期并減少咳嗽次數(shù)，增加氣道酚紅排泌量；在平喘方面可有效減輕哮喘小鼠血管及支氣管周圍的炎性浸潤，減少BALF中各類炎性細胞數(shù)尤其是嗜酸性粒細胞的數(shù)量，降低血清及BALF中IL-4含量。觀察實驗過程中小鼠的生存狀況可知，地龍復方組小鼠生理狀況良好，活潑好動，體重穩(wěn)定增加，而地塞米松組小鼠體形消瘦、急躁、易怒、體重下降，表明長期應用糖皮質(zhì)激素類藥物可對生長發(fā)育造成一定的影響。但地龍復方組小鼠在抑制BALF各類炎癥細胞數(shù)量增多上與陽性藥物組比較仍存在一些差異，可能是地龍復方作用效果較為緩慢，給藥時間需進一步延長，其效果才更為顯著。

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(責任編輯：尹晨茹)

Pharmacodynamics Study on Earthworm Compound Preventing Cough,Removing phlegm and Relieving Asthma

Song Wenshu1,Liu Shunhui1*,Chen Tianyu1,Xu Xiaopeng2

(1.School of Life Sciences and Biopharmaceutics,Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510006,China；2.School of Life Sciences,SunYat sen University,Guangzhou 510275,China)

Objective:To investigate the antitussive,expectorant and antiasthmatic effects of the earthworm compound.Methods:Tussive model induced by nebulization of strong aqua ammonia and expectorant model induced by phenol red in mice were used to investigate the antitussive and expectorant effects respectively;For investigating the antiasthmatic effect,an allergic asthma model sensitized with ovalbumin(OVA) was applied as well as inflammatory invasion scoring and IL-4 ELISA analysis.Results:Earthworm compound could prolong the mice cough incubation period,decrease the frequency of cough and increase bronchial mucus secretion,and at the same time,it could inhibit the increase of inflammatory cells in BALF,reduce the degree of inflammatory infiltrate around the bronchi and vessels in mice.Conclusion:Earthworm compound has certain effects on relieving cough,eliminating phlegm and asthma,especially reducing airway inflammation.

Earthworm Compound;Ephedra;Liquorice;Antitussive;Expectorant;Antiasthma

2014-11-03

國家自然科學青年基金(30901114)

宋雯舒(1988-)，女，廣東藥學院碩士研究生，研究方向為藥理學。E-mail: songwenshu0817@126.com

劉順會(1971-)，男，博士，廣東藥學院副教授，碩士生導師，研究方向為藥物信息學。E-mail: lshhsl00@163.com

R285.5

A

1673-2197(2015)06-0001-04

10.11954/ytctyy.201506001