彭小敏，梁秋平，劉劭勉，余文新，鄧廣海

(廣東省中醫(yī)院 藥學部，廣東 廣州 510120)

?

正交試驗優(yōu)選枸杞黃酮提取工藝

彭小敏，梁秋平，劉劭勉，余文新，鄧廣海*

(廣東省中醫(yī)院 藥學部，廣東 廣州 510120)

目的：優(yōu)選枸杞的最佳提取工藝，為其制劑的制備提供一定參考依據。方法：以總黃酮和蘆丁的測得量為評價指標，采用正交試驗法考察乙醇百分數、料液比、提取時間和提取溫度4個影響因素，優(yōu)選枸杞的超聲提取工藝。結果：枸杞黃酮最佳提取工藝為A3B2C3D3，即乙醇體積分數80%，料液比1︰30，提取時間為30min，提取溫度80℃。結論：該工藝簡單可行，成本低廉，安全可靠，可用于枸杞制劑工業(yè)化生產。

枸杞；總黃酮；蘆?。怀曁崛》?；正交設計

枸杞為茄科植物寧夏枸杞LyciumbarbarumL.的干燥成熟果實[1]，主要分布于寧夏、新疆、內蒙古、青海等地，是我國名貴藥材。寧夏枸杞的化學成分主要為色素類、黃酮類和多糖類，另外含有甜菜堿、維生素C、莨菪亭、多種氨基酸及多種微量元素[3]。研究表明，黃酮類化合物具有抗腫瘤、抗氧化、清除自由基等作用[4-6]，是枸杞的主要有效成分之一。如何科學有效提取枸杞中有效成分一直以來都是中藥制劑研究的熱點，目前，有學者采用熱浸法、微波提取對枸杞中多糖、總黃酮、蘆丁等成分進行提取[7-10]。超聲提取法具有實驗設備簡單，操作方便，提取時間短，產率高，無需加熱等優(yōu)點，在工業(yè)生產中具有廣闊的應用前景。文獻研究表明，以總黃酮和蘆丁含量為評價指標，綜合考察枸杞超聲提取工藝研究未見報道。本文采用正交試驗優(yōu)選枸杞黃酮的超聲提取工藝，為其制劑的制備提供一定參考依據。

1 儀器與材料

Agilent-1100高效液相色譜儀(美國Agilent公司)、UV2401-PC紫外分光光度計(日本島津)、KQ-300VDB型數控超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；蘆丁(批號：100080-201011)對照品均購于中國藥品生物制品檢定所，枸杞(批號：150124751)藥材由康美藥業(yè)股份有限公司提供，經廣州中醫(yī)藥大學中藥鑒定教研室鑒定為枸杞為茄科植物寧夏枸杞Lycium barbarum L. 的干燥成熟果實；甲醇為分析純，乙醇、正丁醇等試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 提取工藝設計

實驗采用超聲提取法考察枸杞中黃酮類成分提取工藝，根據預實驗結果，超聲處理的功率和頻率分別選擇250W，40kHz。對枸杞黃酮類成分溶出度主要影響因素進行考察(乙醇百分數、料液比、提取時間、提取溫度)，每個因素選擇3個水平(見表1)。實驗采用綜合加權評分法，以總黃酮和蘆丁的含量作為評價指標，各指標進行“隸屬度”的計算，其指標隸屬度=(測定值-最小測定值)/(最大測定值-最小測定值)，0≤指標隸屬度≤1。其具體的權重為：總黃酮得率占50%，蘆丁得率占50%。綜合評分=總黃酮得率隸屬度×50%+蘆丁得率隸屬度×50%，滿分為1.00分。

實驗稱取枸杞干燥樣品(過3號篩)2.0 g，加入到100 mL具塞的錐形瓶中，按照L9(34)正交表的試驗順序進行操作，濾過，并用少量80%乙醇洗滌藥渣，洗液并入濾液于100 mL容量瓶中，用80%乙醇定容，搖勻，即得。

表1 影響因素和水平

2.2 總黃酮含量測定

2.2.1 對照品溶液制備 精確稱取120℃干燥至恒重的蘆丁標準品25.2mg，用70%乙醇水浴微熱溶解，并完全轉入50mL容量瓶中，用70%乙醇定容，得0.504mg/mL的蘆丁對照溶液。

2.2.2 標準曲線測定 精確吸取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL蘆丁對照溶液，分別置于10mL容量瓶中，加5%NaNO2溶液1.0mL，搖勻后放置8min，繼續(xù)加10%A1(NO3)3溶液1.0mL，搖勻，放置6min，加1.5 mol/L NaOH溶液5.0mL和60%乙醇至刻度，搖勻，放置10min，然后取3mL于510nm處測定吸收值，繪制標準曲線，得標準曲線方程為：A=12.131C-0.001 4(r=0.999 5)，說明對照品溶液在0.020 4～0.100 8mg/mL范圍內線性關系良好。

2.2.3 精密度考察 精密移取蘆丁對照品1.0mL，平行操作5次，按照“2.2.2”項下步驟操作，測定其吸光度A，計算RSD(n=5)值,結果其RSD=0.19%。

2.2.4 含量測定 精確吸取供試品溶液1.0mL，按照“2.2.2”項步驟操作，測定枸杞中總黃酮的含量。

2.3 蘆丁含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Extend C18(250mm×4.6mm,5μm) ；流動相：甲醇-0.5%磷酸水溶液(40︰60)；流速：1.0mL/min；柱溫：25℃；檢測波長：255nm；進樣量為5μL。

2.3.2 對照品溶液制備 精密稱取蘆丁對照品適量，置10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制得0.132mg/mL蘆丁的對照品混合溶液，過0.45μm微孔濾膜，即得。

2.3.3 供試品溶液處理 精密供試品溶液50mL，40℃減壓濃縮，濃縮液經HPD-600型大孔樹脂，蒸餾水洗脫除去水溶性雜質后，再用50%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液50mL為供試品溶液，搖勻，過0.45μm微孔濾膜，即得。

2.3.4 標準曲線制備 精密吸取對照品溶液1mL置于2、5、10、20、25mL棕色容量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，按照上述色譜條件，測定蘆丁的峰面積，以峰面積Y為縱坐標，進樣量(μg)為橫坐標繪制標準曲線，得到回歸方程為：Y=4 752.3X+16.324(R2=0.999 6)；線性范圍為：0.005 28～0.13200mg/mL。

2.3.5 含量測定 按照上述“2.3”項下的含量測定方法，測定枸杞不同提取液樣品中蘆丁的含量。結果見表2、圖1。

表2 枸杞超聲提取工藝正交設計實驗結果

表3 方差分析結果

注：F0.01(2,2)=99,F0.05(2,2)=19。

極差R結果表明，影響枸杞中黃酮提取工藝程度依次為：D(提取溫度)>A(乙醇百分數)>B(料液比)>C(提取時間)，方差分析結果表明，A、D(P<0.05)兩個因素對枸杞提取工藝有明顯的影響，因素B、C均沒有明顯的差異，為了節(jié)省溶劑，經綜合考慮，得出最佳的提取工藝為：A3B2C3D3，即乙醇體積分數80%，料液比1︰30，提取時間為30min，提取溫度80℃。

3 討論

枸杞具有滋補肝腎、益精明目的作用，為臨床廣泛使用的補益藥。研究表明，黃酮類成分是枸杞的主要有效成分，如何利用現代技術，簡單快捷、高效地提取其有效成分是目前研究的熱點，也是其制劑生產迫切需要解決的問題。枸杞黃酮提取方法較多，實驗比較了微波提取法、回流提取法和超聲提取法，結果表明超聲提取法所得到的總黃酮提取率較大，為進一步優(yōu)化枸杞黃酮的超聲提取工藝，實驗對其主要影響因素進行了考察，最終優(yōu)選出枸杞的最佳提取工藝，該工藝操作簡單、省時、成本低廉，穩(wěn)定性好，應用于工業(yè)化生產將產生一定的經濟效益，為該藥材綜合利用開發(fā)提供理論依據。

圖1 枸杞黃酮提取液含量測定HPLC色譜

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:232.

[2] 張磊,鄭國崎,膝迎鳳,等.不同產地寧夏拘把果實品質比較研究[J].西北藥學雜志,2012,2(73)：195-198.

[3] 黃燕萍.枸杞的研究進展[J].中國基層醫(yī)藥,2010,17(1)：125-127.

[4] 劉成梅,游海.天然產物有效成分的分離與應用[M].北京:化學工業(yè)出版社,2003:1.

[5] 黃元慶,譚安民,沈泳,等.枸杞黃酮類化合物清除氧自由基及對小鼠L1210癌細胞能量代謝的抑制作用[J].衛(wèi)生研究,1998,27(2):109.

[6] 黃元慶,魯建華,沈泳,等.枸杞總黃酮類化合物抗脂質過氧化研究[J].衛(wèi)生研究,1999,28(2):115.

[7] 劉軍海,任惠蘭,李風風,等.響應面分析法優(yōu)化枸杞多糖提取工藝條件[J].時珍國醫(yī)國藥,2008,19(4):935-937.

[8] 韓榮生,李鵬.枸杞中總黃酮提取工藝的研究[J].國醫(yī)論壇,2011,26(2):39-42.

[9] 張義軍,陳麗.均勻設計法優(yōu)選枸杞提取工藝[J].時珍國醫(yī)國藥,2008,19(10): 2457-2458.

[10] 羅永,曾雪花.枸杞子不同濃度乙醇提取物中總黃酮含量比較研究[J].安徽醫(yī)學,2011,32(5)：646-647.

(責任編輯：余 婷)

Ultrasonic-assisted Extraction of flavonoids from Lycium barbarum L

Peng Xiaoming,Liang Qiuping,Liu Shaomian,Yu Wenxin，Deng Guanghai*

(Department of Pharmacy,Guangdong Provincial Hospital of TCM,Guangzhou 510120,China)

Objective:To select the ultrasonic-assisted extraction conditions from Lycium barbarum L. and provide a reference for the preparation of the formulation. Methods:With the extraction rate of total flavonoids and rutoside as the investigation index,to study four factors of ethanol percentage,solid-liquid ratio,extraction time and extraction temperature by orthogonal design,and the best extraction conditions was optimized. Results:The best ultrasonic extraction conditions were 80% ethanol percentage,solid-liquid ratio was 1∶30,extraction time was 30 min,extraction temperature was 80 °C. Conclusion:The process was simple and feasible,low-cost,safe and reliable,and could be used for industrial production of sarsaparilla preparations.

Lycium Barbarum L.;Total Flavonoids;Rutoside;Ultrasonic Extraction;Orthogonal Design

2015-04-18

彭小敏，女，廣東省中醫(yī)院中藥師，研究方向為醫(yī)院藥學。

鄧廣海(1983-)，男，碩士，廣東省中醫(yī)院主管中醫(yī)師，研究方向為中藥劑量鑒定。

R284

A

1673-2197(2015)17-0024-03

10.11954/ytctyy.201517012