鄧少東，盧洪梅，林 勵(lì)，林靖然，張 鵬

(1.廣東醫(yī)學(xué)院 第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 東莞 523808；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

?

體內(nèi)探針?biāo)幬锓ㄑ芯堪完斓途厶菍?duì)大鼠CYP3A4的影響

鄧少東1，盧洪梅1，林 勵(lì)2，林靖然2，張 鵬2

(1.廣東醫(yī)學(xué)院 第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 東莞 523808；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

目的：研究巴戟天低聚糖(BD)及其活性成分巴戟甲素(BJ)對(duì)肝藥酶CYP3A4的影響。方法：采用固相萃取法處理血樣，UPLC測(cè)定探針?biāo)幬锇北巾吭诖笫篌w內(nèi)的血藥濃度，采用DAS2.0軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)并進(jìn)行比較分析。結(jié)果：BD對(duì)CYP3A4有顯著的誘導(dǎo)作用，而B(niǎo)J對(duì)CYP3A4有抑制作用。結(jié)論：巴戟天中含有大量對(duì)CYP3A4有誘導(dǎo)作用的低聚糖類成分，與其他通過(guò)CYP3A4酶代謝的藥物合用時(shí)需注意配伍禁忌。

巴戟天；低聚糖；巴戟甲素；肝藥酶CYP3A4

肝臟是重要的藥物代謝器官，是藥物生物轉(zhuǎn)化的主要場(chǎng)所，其中細(xì)胞色素P450酶(CYP450)是肝臟中重要的代謝外源性和內(nèi)源性化合物的混合功能氧化酶系，同時(shí)在激活各種毒性物質(zhì)及前致癌物中發(fā)揮著重要作用[1]。CYP450酶系活性的改變可影響外源物的代謝，進(jìn)而對(duì)其藥理或毒理活性產(chǎn)生影響。在機(jī)體中，大部分處方藥均需要在CYP450酶系統(tǒng)參與下通過(guò)Ⅰ相和Ⅱ相代謝反應(yīng)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化。CYP450同工酶易受到藥物或其他化合物的誘導(dǎo)或抑制，這是藥物間發(fā)生相互作用的主要原因。其中CYP450中的亞型酶CYP3A4是人類肝臟中重要的代謝酶，約有55%藥物經(jīng)CYP3A4代謝[2]。CYP450酶的活性可通過(guò)一些特異性敏感底物來(lái)測(cè)定，稱為探針?biāo)幬锓?，是測(cè)定其相關(guān)亞型酶活性的常用方法[3-4]，其中氨苯砜為CYP3A4常用的探針?biāo)幬颷5-6]。

巴戟天為茜草科植物巴戟天MorindaofficinalisHow.的肉質(zhì)根，歸腎、肝經(jīng)，自古被譽(yù)為“補(bǔ)腎陽(yáng)之要藥”，是我國(guó)著名的“四大南藥”之一。巴戟天無(wú)論是組方配伍的湯劑，還是提取物制成的制劑、保健品等，均已被廣泛應(yīng)用。然而至今還未發(fā)現(xiàn)關(guān)于巴戟天中有效成分對(duì)CYP450主要亞型酶活性影響的系統(tǒng)研究。因此，本實(shí)驗(yàn)以氨苯砜為探針底物，考察巴戟天低聚糖提取物(BD)及其主要活性成分巴戟甲素(BJ)對(duì)CYP3A4活性的影響，以預(yù)測(cè)其聯(lián)合應(yīng)用CYP3A4亞型酶代謝型藥物時(shí)發(fā)生相互作用的可能性，從而為該藥的開(kāi)發(fā)及臨床合理應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 試藥

巴戟天低聚糖提取物(自制，純度>98%)；巴戟甲素(按專利201010224513.2方法自制，純度>98%)；氨苯砜對(duì)照品 (美國(guó)Sigma公司，純度98%，批號(hào)：SZBC072XV)；內(nèi)標(biāo)為苯巴比妥(中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度99%，批號(hào)：171222-200605)；乙腈、甲醇(色譜純，德國(guó)Merkel公司)，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；實(shí)驗(yàn)用水為自制超純水。

1.2 儀器

美國(guó)Waters ACQUITY UPLC系統(tǒng)(QSM四元溶劑管理系統(tǒng)、FTN樣品管理系統(tǒng)自動(dòng)進(jìn)樣器、CH-A型柱溫箱、UPLC專用二極管陣列檢測(cè)器、真空脫氣機(jī)、Empower3 色譜工作站)；BP211D型十萬(wàn)分之一電子天平(德國(guó)Sartorius公司)；KQ-500型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Genpure超純水系統(tǒng)(德國(guó)TKA公司)；Cleanerrt固相萃取柱(天津博納艾杰爾科技有限公司，C18，50～100mg)；12位負(fù)壓SPE固相萃取裝置(天津博納艾杰爾科技有限公司)；MTN-2800D型氮吹儀(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；佳美SK-1快速混勻器(江蘇金壇市佳美儀器廠)；TGL-16aR型臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.3 動(dòng)物

雄性SD大鼠，18只，體重200～250g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證號(hào)：SCXK(粵)2008-0020]，實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物禁食12h，自由飲水。

2 方法與結(jié)果

2.1 分組、給藥及樣品采集

將18只SD大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、巴戟天低聚糖提取物組(BD組)、巴戟甲素組(BJ組)，每組6只。BD組大鼠每天清晨按240mg·kg-1的劑量灌胃給藥，BJ組大鼠按80mg·kg-1的劑量灌胃給藥，空白對(duì)照組大鼠按10mg·kg-1的劑量灌胃給藥，連續(xù)給藥14天。于第15天清晨尾靜脈注射探針?biāo)幬锇北巾?，按?mg·kg-1的劑量給藥，于探針給藥后0、2、5、10、30、60、90、120、240、360、480、600min從大鼠眼底靜脈叢采血，每次采血約0.5mL，靜置30min，再以3 000rpm·min-1轉(zhuǎn)速離心5min，取出上清液，于-80℃冰箱中保存。

2.2 固相萃取柱活化

取C18固相萃取小柱，加入4mL甲醇活化，再加入超純水4mL平衡萃取柱，最后加入5%甲醇4mL沖洗萃取柱，備用。

2.3 血樣前處理

精密吸取含藥血清200μL，加入800μL超純水和40μL內(nèi)標(biāo)溶液(含苯巴比妥105μg·mL-1)，渦旋混勻30s后，加入已活化的C18固相萃取小柱中，靜置5min后，加入1mL超純水，以2mL·min-1流速洗脫雜質(zhì)，再加入2mL甲醇以0.5mL·min-1流速洗脫目標(biāo)物，收集洗脫液，氮?dú)獯蹈?，殘留物中精密加?00μL甲醇渦旋溶解，待測(cè)。

2.4 色譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(3.0mm×100mm，1.7μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.1%乙酸水溶液(36∶64)，等度洗脫；流速：0.3mL·min-1；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：258nm；進(jìn)樣量：2μL。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性實(shí)驗(yàn) 分別取空白血清、空白血清+氨苯砜+內(nèi)標(biāo)、注射氨苯砜后采集的血清，按照“2.3”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣分析。結(jié)果顯示，氨苯砜和內(nèi)標(biāo)苯巴比妥的保留時(shí)間分別為2.452、3.072min，兩個(gè)色譜峰互不干擾且血清中內(nèi)源性雜質(zhì)不影響分析物的測(cè)定，具有良好的特異性和分離度(見(jiàn)圖1)。

圖1 專屬性實(shí)驗(yàn)色譜

注：a.空白血清；b.空白血清+氨苯砜+內(nèi)標(biāo)；c.給藥后10min；d.給藥后10h；1.氨苯砜；2.苯巴比妥

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密稱取氨苯砜對(duì)照品適量，加入超純水溶解配制得4μg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液0.625、1.25、2.5、5、10、20mL置于2mL容量瓶中，以超純水定容至刻度，搖勻，配制得濃度分別為0.125、0.25、0.5、1、2、4μg·mL-1的氨苯砜對(duì)照品工作液。精密吸取以上6種濃度的工作液各200μL，分別加入200μL空白血清、600μL超純水和40μL內(nèi)標(biāo)溶液(含苯巴比妥105μg·mL-1)，按照“2.3”項(xiàng)下方法處理, 進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以氨苯砜濃度X(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，氨苯砜和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：Y= 2.039 3X -0.079 1(r=0.998 7)。結(jié)果表明，氨苯砜血藥濃度在0.125～4μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積比值線性關(guān)系良好。

2.5.3 精密度與回收率 精密吸取“2.5.2”項(xiàng)下配制的0.125、1.000、4.000μg·mL-1對(duì)照品工作液各200μL，分別加入200μL空白血清、600μL超純水和40μL內(nèi)標(biāo)溶液(含苯巴比妥105μg·mL-1)，按照“2.3”項(xiàng)下方法處理，平行制備5份，于同一天內(nèi)測(cè)定5次和連續(xù)5天分別測(cè)定1次，計(jì)算日內(nèi)和日間精密度，以RSD表示。以測(cè)得濃度與配制的理論濃度進(jìn)行比較，計(jì)算該方法的回收率。結(jié)果顯示(見(jiàn)表1)，探針?biāo)幬锏娜諆?nèi)、日間精密度RSD均<10%，表明該實(shí)驗(yàn)精密性良好。探針?biāo)幬镌诘汀⒅?、?個(gè)質(zhì)量濃度的樣品中回收率均介于81. 87%～104. 31%之間，符合藥動(dòng)學(xué)樣品測(cè)定的要求。

表1 精密度與回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=5)

2.5.4 樣品穩(wěn)定性 取給予探針?biāo)幬?0、240、600min后采集的血清適量，按照“2.3”項(xiàng)下方法處理，于室溫中放置。分別取以上3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)制備的樣品于1、2、4、8、12h后分別進(jìn)樣分析，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)氨苯砜的濃度，以放置12h內(nèi)各樣品濃度的RSD表示其穩(wěn)定性。結(jié)果顯示(見(jiàn)表2)，3個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)所采集的樣品在12h內(nèi)進(jìn)樣，氨苯砜濃度的RSD均在5%之內(nèi)，表明在該實(shí)驗(yàn)條件下，血清樣品在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2.7 探針?biāo)幬锼?時(shí)曲線

空白對(duì)照組、BD組、BJ組SD大鼠尾靜脈注射氨苯砜后，按照“2.1”及“2.3”項(xiàng)下方法操作，測(cè)得其血藥濃度。結(jié)果見(jiàn)表3、圖2。

表3 各組大鼠不同時(shí)點(diǎn)測(cè)得探針?biāo)幬镅袧舛?/p>

組別時(shí)間t(min)2510306090120240360480600空白組0.60±0.121.87±0.183.09±0.442.12±0.131.82±0.161.45±0.201.34±0.130.99±0.150.82±0.120.49±0.070.35±0.05BD組0.48±0.051.04±0.132.51±0.711.89±0.481.52±0.291.20±0.2880.91±0.160.60±0.120.39±0.090.27±0.060.14±0.03BJ組0.39±0.031.38±0.111.95±0.211.28±0.091.18±0.081.15±0.071.00±0.160.84±0.120.59±0.030.47±0.050.31±0.04

圖2 探針?biāo)幬锏钠骄?時(shí)曲線

2.8 探針?biāo)幬飫?dòng)學(xué)參數(shù)

采用DAS2.0軟件處理氨苯砜藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)，經(jīng)擬合后，氨苯砜的藥-時(shí)曲線符合一房室模型，空白組、BD組、BJ組的權(quán)重分別為1/CC、1/CC、1。同時(shí)采用非房室模型統(tǒng)計(jì)矩原理計(jì)算得各項(xiàng)參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表4。

采用SPSS19.0進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果顯示：與空白組比較，BD組大鼠t1/2、MRT0-∞均顯著降低(P<0.05)；而B(niǎo)J組大鼠t1/2、MRT0-∞均顯著增加(P<0.01)。經(jīng)過(guò)綜合分析，巴戟天低聚糖部位對(duì)CYP3A4有顯著的誘導(dǎo)作用，而巴戟甲素對(duì)CYP3A4有顯著的抑制作用。

表4 大鼠血液中探針?biāo)幬飫?dòng)力學(xué)參數(shù) ±s，n=6)

注：△P<0.05，△△P<0.01 vs 空白組。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)建立的固相萃取-超高效液相色譜法適用于血液中氨苯砜濃度的測(cè)定，其專屬性強(qiáng)、精密度好、回收率高。本研究采用體內(nèi)探針?biāo)幬锓ㄔu(píng)價(jià)了巴戟天低聚糖部位和巴戟甲素對(duì)CYP450酶系的影響。在非房室模型分析中，MRT是一個(gè)非常重要的參數(shù)，由于藥物代謝遵從“對(duì)數(shù)-正態(tài)分布”，靜脈注射給藥時(shí)MRT表示的是藥物被機(jī)體消除給藥劑量的63.2%所需要的時(shí)間。通過(guò)對(duì)半衰期t1/2與平均滯留時(shí)間MRT0-∞進(jìn)行綜合分析，表明巴戟天低聚糖部位對(duì)CYP3A4有顯著的誘導(dǎo)作用，而巴戟甲素對(duì)CYP3A4有顯著的抑制作用，提示巴戟天低聚糖部位中可能還含有大量對(duì)CYP3A4有較強(qiáng)誘導(dǎo)作用的低聚糖類成分。

作為原料藥，巴戟天提取物在中藥組方配伍、制藥、保健品開(kāi)發(fā)中被廣泛應(yīng)用。在臨床用藥中，巴戟天可能與其他藥物聯(lián)合用藥，值得注意的是，在與其他通過(guò)CYP3A4酶代謝的藥物合用時(shí)，需密切監(jiān)測(cè)血藥濃度，根據(jù)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)調(diào)整給藥方案。

[1] OMURA T. Heme-thiolate proteins[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2005, 338(1):404.

[2] 劉高峰,甄立棉,黃麗軍. RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定家兔體內(nèi)氨苯砜、咖啡因和美托洛爾的含量[J].藥物分析雜志,2010(12):2263.

[3] 和凡,趙立子,畢惠嫦,等. 6種細(xì)胞色素P450酶亞型特異性底物的酶動(dòng)力學(xué)研究[J].中國(guó)藥房,2009，20(17):1310.

[4] 張鑒,彭向前,李軍.咖啡因探針?lè)y(cè)定正常人肝臟藥物代謝酶 CYP1A2活性[J].中國(guó)藥房,2005,16(16):1216.

[5] 謝建芬,陳榮,夏宗玲,等.HPLC法測(cè)定人血清中CYP3A4探針?biāo)幬锇北巾康臐舛萚J].中國(guó)藥房,2011,18(10):889.

[6] 扈金萍,閆淑蓮,徐艷霞,等.反相高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)3種探針?biāo)幬颷J].色譜,2002,20(6):540.

(責(zé)任編輯：尹晨茹)

Effect of Oligosaccharides from Morinda Officinalis on CYP3A4 Using the Probe Drug Method in Vivo

Deng Shaodong1, Lu Hongmei1, Lin Li2, Lin Jingran2, Zhang Peng2

(1.The Second School of Clinical Medicine,Guangdong Medical College,Dongguan 523808,China;2.College of Chinese Materia Medica,Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine,Guangzhou 510006,China)

Objective:To investigate the effects of BD and BJ on CYP3A4 for the safety assessment.Methods:Plasma was treated by SPE. The plasma concentration of probe drug dapsone was determinated by UPLC. The pharmacokinetic parameters were calculated by DAS2.0.Results:BD induced CYP3A4 in vivo while BJ inhibited CYP3A4.Conclusion:Oligosaccharides of Morinda officinalis contain a lot of Oligosaccharides that can induced CYP3A4 in vivo.When Oligosaccharides of Morinda officinalis are used combined with other drugs which are metablized by CYP3A4 enzyme, the different effects should be considered to avoid the potential adverse reactions.

MorindaofficinalisHow.;Oligosaccharide; Bajijiasu;CYP3A4

2015-04-01

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81403085)；東莞市醫(yī)療衛(wèi)生科技計(jì)劃一般項(xiàng)目(2014105101295)；廣東醫(yī)學(xué)院科研基金博士學(xué)位人員科研啟動(dòng)項(xiàng)目(B2013007)

鄧少東(1986-)，男，廣東醫(yī)學(xué)院博士，研究方向?yàn)橹兴庂Y源開(kāi)發(fā)利用與新藥研發(fā)。

R285.5

A

1673-2197(2015)17-0005-04

10.11954/ytctyy.201517003