王雅琦

(哈藥集團(tuán)制藥六廠，黑龍江 哈爾濱 150056)

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墓頭回總黃酮提取工藝研究

王雅琦

(哈藥集團(tuán)制藥六廠，黑龍江 哈爾濱 150056)

目的：探討墓頭回總黃酮的最佳提取工藝。方法：采用超聲提取法提取墓頭回中的總黃酮，采用比色法測(cè)定總黃酮含量，以總黃酮得率為指標(biāo)，考察乙醇濃度、料液比和超聲時(shí)間對(duì)墓頭回總黃酮提取率的影響，利用響應(yīng)面分析法確定墓頭回總黃酮的最佳提取工藝。結(jié)果：墓頭回總黃酮的最佳提取工藝為：加30倍量的60%乙醇超聲提取20min。結(jié)論：該提取工藝得率高、操作簡(jiǎn)便，具有周期短、精度高等優(yōu)點(diǎn)，可用于工業(yè)化大生產(chǎn)。

墓頭回；總黃酮；提取工藝

墓頭回為敗醬科敗醬屬植物異葉敗醬或糙葉敗醬的根莖和根，性涼，味苦、微酸澀，根及全草入藥用，具有燥濕止帶、收斂止血、清熱解毒的功效，主治赤白帶下、泄瀉痢疾、瘡瘍腫毒等[1]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)墓頭回中黃酮類化合物的藥理作用進(jìn)行了研究，在抗腫瘤、抗氧化、抗炎、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等[2]方面取得了顯著進(jìn)展。超聲波輔助提取法是提取天然成分的常用方法[3]。目前關(guān)于墓頭回總黃酮的最佳提取工藝研究報(bào)道較少，本文采用響應(yīng)面分析法，考察影響提取效果的主要因素，確定最佳提取工藝條件，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UV-2600紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)、KQ5200超聲清洗器、電子分析天平等。

1.2 試藥

槲皮素(批號(hào)：100081-201481)，購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；墓頭回，購(gòu)于安徽亳州；其他試劑均為分析純。

2 方法學(xué)考察

2.1 對(duì)照品溶液制備

精密稱取槲皮素對(duì)照品7.3mg，置于25mL容量瓶中，加適量60%乙醇，超聲片刻使之溶解，加60%乙醇定容至刻度，得濃度為0.292mg/mL的對(duì)照品溶液，備用。

2.2 供試品溶液制備

稱取1.0g墓頭回藥材粗粉，加20mL 60%乙醇超聲提取20min，過(guò)濾，用60%乙醇定容至25mL容量瓶中，得濃度為40mg/mL的供試品溶液，備用。

2.3 最大吸收波長(zhǎng)確定

精密吸取對(duì)照品溶液1.0mL，置于25mL容量瓶中，按照“2.4”項(xiàng)下顯色方法操作，于200～800nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，確定其最大吸收波長(zhǎng)為480nm。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取對(duì)照品溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mL，分別置于25mL容量瓶中，加60%乙醇至6mL，加5% NaNO2溶液1.0mL，放置6min，加10%Al(NO3)3溶液1.0mL，放置6min，加10%NaOH溶液10mL，定容至刻度，搖勻，放置15min，以相應(yīng)試劑作空白對(duì)照，于480nm處測(cè)定吸光度。以吸光度(y)為縱坐標(biāo)，以樣品濃度x為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：y=0.265 5x+0.025 3，r=0.999 0。結(jié)果表明：槲皮素在0.012～0.047mg范圍內(nèi)與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一對(duì)照品溶液1.0mL，置于25mL容量瓶中，按照“2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，平行測(cè)定6次，計(jì)算得吸光度RSD為0.25%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一對(duì)照品溶液1.0mL，置于25mL容量瓶中，按照“2.4”項(xiàng)下方法，分別于放置30、60、90、120、150、180min后測(cè)定吸光度，計(jì)算得RSD為1.49%，表明樣品溶液在180min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液1.0mL，置于25mL容量瓶中，按照“2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，平行測(cè)定6次，計(jì)算得RSD為0.21%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取9份已知總黃酮含量的藥材粉末，隨機(jī)分為3組，各組分別精密加入已知含量80%、100%、120%的槲皮素對(duì)照品，按照供試品制備方法制備樣品溶液，于“2.4”項(xiàng)下顯色條件測(cè)定總黃酮含量，計(jì)算得加樣回收率為99.0%，RSD為1.67%。

3 單因素考察

3.1 乙醇濃度考察

稱取1g墓頭回藥材粗粉5份，固定超聲時(shí)間為20min、料液比為1∶20，分別采用濃度為40%、50%、60%、70%、80%的乙醇提取，測(cè)定其吸光度，結(jié)果見(jiàn)圖1。乙醇濃度選取40%、50%和60%作為提取工藝優(yōu)化的3個(gè)水平。

圖1 吸光度響應(yīng)面分析

3.2 料液比考察

稱取藥材(過(guò)60目篩)適量，固定超聲時(shí)間為20min、乙醇濃度為60%，分別用料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50進(jìn)行提取，測(cè)定其總黃酮含量，選擇三個(gè)最佳的料液比進(jìn)行考察，分別為1∶10、1∶20、1∶30。

3.3 超聲時(shí)間考察

稱取藥材(過(guò)60目篩)適量，固定乙醇濃度為60%、料液比為1∶20，分別超聲提取10、20、30、40、50min，測(cè)定其總黃酮含量，選擇3個(gè)最佳的超聲時(shí)間進(jìn)行考察，分別為10、20、30min。

3.4 提取工藝優(yōu)化

根據(jù)Box-Benhnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在選定溫度為25℃的前提下，選擇乙醇濃度、料液比和超聲時(shí)間3個(gè)因素作為自變量設(shè)計(jì)響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，分別以A、B、C表示，每個(gè)自變量的低、中、高水平分別以-1、0、1 進(jìn)行編碼，以墓頭回總黃酮提取得率作為響應(yīng)值Y，結(jié)果見(jiàn)表1。采用Design-Expert軟件對(duì)表1結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，得擬合方程：含量=-370.01175+10.83762×A+8.29930×B+2.89508×C-0.025875×A×B-0.10223×A2-0.12781×B2-0.076280×C2。由方差分析可知，擬合方程有較高的擬合度，理論最佳提取工藝為：加30倍的60%乙醇超聲提取20min，藥材有效成分能最大程度地溶出。

表1 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：共有17 個(gè)實(shí)驗(yàn)，其中12 個(gè)為析因?qū)嶒?yàn)，5個(gè)為中心實(shí)驗(yàn)，以估計(jì)誤差。

4 討論

傳統(tǒng)的數(shù)理統(tǒng)計(jì)方法往往采用正交設(shè)計(jì)或均勻設(shè)計(jì)，可同時(shí)考慮多種因素，尋求最佳因素水平組合，但其不能在給出的整個(gè)區(qū)域中找出因素和響應(yīng)值之間明確的函數(shù)表達(dá)式，即回歸方程，因而無(wú)法找到整個(gè)區(qū)域中因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值。響應(yīng)面分析方法是通過(guò)中心組合實(shí)驗(yàn)研究幾種實(shí)驗(yàn)因素間交互作用的一種回歸分析方法，具有試驗(yàn)次數(shù)少、周期短、回歸方程精度高等優(yōu)點(diǎn)，并可從圖形方面分析尋求最優(yōu)考察因素值。

本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面分析法對(duì)墓頭回總黃酮提取工藝進(jìn)行研究，實(shí)驗(yàn)所確定的提取工藝具有提取得率高、操作簡(jiǎn)便、成本較低等優(yōu)點(diǎn)，為墓頭回總黃酮提取工藝的優(yōu)化及墓頭回植物資源的開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)。

[1] 蔡光先.湖南藥物志[M].長(zhǎng)沙:湖南科學(xué)技術(shù)出版社,2004:4857-4859.

[2] 江蘇醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[M].上海:上海人民出版社,1986.

(責(zé)任編輯：尹晨茹)

2015-07-12

王雅琦(1979-)，女，黑龍江省哈藥集團(tuán)制藥六廠主管藥師，研究方向?yàn)樗幬镔|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及工藝。

R384.1

A

1673-2197(2015)22-0030-02

10.11954/ytctyy.201522012