陳志恒，馬晉芳，肖 雪,3，梁 潔，李莎莎

(1.濰坊市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，山東 濰坊 261205；2.中山大學(xué) 南沙研究院，廣東 廣州 511458； 3.廣東藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；4.廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州 510006)

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參芪王漿養(yǎng)血口服液單糖成分高效液相指紋圖譜研究

陳志恒1，馬晉芳2，肖 雪2,3，梁 潔3*，李莎莎4*

(1.濰坊市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，山東 濰坊 261205；2.中山大學(xué) 南沙研究院，廣東 廣州 511458； 3.廣東藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；4.廣東省中醫(yī)院，廣東 廣州 510006)

目的：將參芪王漿養(yǎng)血口服液經(jīng)3-甲基-1-苯基-5-吡唑啉酮(PMP)試劑衍生化后，采用高效液相色譜法建立其單糖類成分的指紋圖譜，為該制劑的質(zhì)量控制提供依據(jù)。方法：采用Phenomenex Luna RP C18(250mm×4.6mm，5 μm)色譜柱，流動相為0.1mol/L磷酸二氫鉀緩沖鹽(pH=6.7)(A)-乙腈(B)，梯度洗脫，流速為1.0mL/min，檢測波長為250nm。結(jié)果：建立了參芪王漿養(yǎng)血口服液中單糖類成分的HPLC指紋圖譜，以10個共有峰作為參照峰，采用指紋圖譜評價軟件計(jì)算相似度均≥0.85。結(jié)論：采用高效液相色譜法建立參芪王漿養(yǎng)血口服液單糖類成分的指紋圖譜可為該制劑的內(nèi)在質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

參芪王漿養(yǎng)血口服液；單糖；高效液相色譜法；指紋圖譜

參芪王漿養(yǎng)血口服液(Nourishing Oral Liuid of Royal Jelly, Ginseng and Astragalus Root)由人參、黃芪、當(dāng)歸、蜂王漿等原料經(jīng)現(xiàn)代生產(chǎn)工藝加工而成，主要功效為補(bǔ)益氣血、養(yǎng)心安神，可用于氣血兩虛證的治療，癥見神倦乏力、食欲不振、失眠等[1]。目前參芪王漿養(yǎng)血口服液執(zhí)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)較低，不能有效控制產(chǎn)品質(zhì)量。與傳統(tǒng)的檢測手段相比，指紋圖譜是國際公認(rèn)的控制中藥質(zhì)量最有效的方法之一，其可較為全面地反映多種成分在中藥中的含量分布情況[2-4]。在前期的研究基礎(chǔ)上[5-6]，本試驗(yàn)進(jìn)一步對衍生化后的參芪王漿養(yǎng)血口服液進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)分析，建立了該制劑中單糖類成分的HPLC指紋圖譜，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UltiMate 3000高效液相色譜儀，包括梯度泵SR-3000，自動進(jìn)樣器WPS-3000，柱恒溫系統(tǒng)TCC-3000，紫外檢測器DAD-3000，色譜工作站變色龍7.2(美國Thermo公司)；XS-205 DualRange型十萬分之一分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)。

1.2 試藥

乙腈(色譜純，F(xiàn)isher公司)，甲醇、磷酸二氫鉀緩沖鹽、3-甲基-1-苯基-5-吡唑啉酮(PMP)、鹽酸、氫氧化鈉、氫氧化鉀均為分析純(廣州化工廠)，純化水自制。

參芪王漿養(yǎng)血口服液由吉林敖東延邊藥業(yè)股份有限公司提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 PMP甲醇溶液配制

稱取21.775g PMP于250mL容量瓶中，采用甲醇溶解并定容至刻度，以超聲助溶。

2.2 色譜條件

色譜柱為Phenomenex Luna RP C18(250mm×4.6mm，5μm)，流動相為0.1mol/L磷酸二氫鉀緩沖鹽(pH=6.7)(A)-乙腈(B)，梯度洗脫，流速為1.0mL/min，柱溫為30℃，檢測波長為250nm。見表1。

表1 流動相洗脫程序

2.3 樣品供試品制備

精密量取參芪王漿養(yǎng)血口服液1mL于100mL容量瓶中，用純化水定容至刻度，以0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

2.4 樣品衍生化

精密吸取參芪王漿養(yǎng)血口服液稀釋品溶液200μL 2份于具塞離心管中，分別編號為樣品1、樣品2，加入0.3mol/L NaOH 200μL，充分混勻，后加0.5mol/L PMP甲醇溶液160μL，混勻后置于70℃水浴加熱30min，取出放冷，再加0.3mol/L HCl 200μL中和堿液，加純化水1 240μL、氯仿2mL，搖勻，3 500轉(zhuǎn)/min離心5min，棄去氯仿層。重復(fù)萃取3次，水層過0.45μm濾膜，收集濾液注入HPLC。分別取5μL各供試品溶液衍生化后，注入HPLC儀進(jìn)行測定。見圖1。

圖1 參芪王漿養(yǎng)血口服液中單糖衍生化后的色譜

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗(yàn) 取批號為“1202001”的參芪王漿養(yǎng)血口服液成品，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄指紋圖譜，以9號峰為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果表明，各共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD分別小于1.0%和3.0%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號為“1202001”的參芪王漿養(yǎng)血口服液成品6支，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測定，記錄指紋圖譜，以9號峰為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果表明，各共有峰相對保留時間和相對峰面積RSD分別小于1.0%和3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號為“1202001”的參芪王漿養(yǎng)血口服液成品，按照“2.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、8、16、24h進(jìn)樣測定，記錄指紋圖譜。以9號峰為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果表明，各共有峰相對保留時間和相對峰面積RSD均小于3.0%，表明樣品溶液在24h內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定。

2.6 參芪王漿養(yǎng)血口服液指紋圖譜相似度研究[7-9]

分別精密量取多批供試品溶液各5μL，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄指紋圖譜，通過指紋圖譜評價軟件(中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)，2004A版)分析，以10個共有峰為參照峰。將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)導(dǎo)入指紋圖譜相似度評價軟件，經(jīng)自動匹配，生成對照指紋圖譜(S)，見圖2。各樣品與對照色譜圖進(jìn)行比較，采用夾角余弦法計(jì)算相似度，進(jìn)行整體相似度評價。通過相似度分析，發(fā)現(xiàn)各批樣品的相似度均在0.85以上，樣品相似性良好。見表2。

圖2 參芪王漿養(yǎng)血口服液參照指紋圖譜

批號S1S2S3S4S5S6S7S8S9相似度0．8990．9990．9930．9940．9950．9940．9950．9940．995

3 討論

按照國家藥典委員會關(guān)于“中藥注射液指紋圖譜研究的技術(shù)要求(暫行)通知”，采用HPLC梯度洗脫法對參芪王漿養(yǎng)血口服液中的單糖類成分進(jìn)行了指紋圖譜研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法可操作性強(qiáng)、重復(fù)性好，可為參芪王漿養(yǎng)血口服液中單糖成分的研究提供參考依據(jù)。

本試驗(yàn)考察了不同溫度下單糖指紋圖譜的分離度，發(fā)現(xiàn)25℃時指標(biāo)峰分離度變差，35℃和40℃時基線漂移較為嚴(yán)重，而30℃時基線較為平穩(wěn)，分離度也較好。同時本試驗(yàn)也考察了多個流速的指紋圖譜，流速為0.5mL/min和0.8mL/min時，色譜不能完全出峰；流速為1.2mL/min時，各指標(biāo)峰的保留時間變小，分離度降低；當(dāng)流速為1.0mL/min時，各色譜峰分離度較高，峰型較好，因此確定1.0mL/min為參芪王漿養(yǎng)血口服液單糖指紋圖譜的洗脫流速。

本研究采用衍生化法測定9批參芪王漿養(yǎng)血口服液中單糖成分的相似度，經(jīng)指紋圖譜相似度軟件分析，其相似度均在0.85以上。本實(shí)驗(yàn)所建立的方法精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性均符合指紋圖譜的技術(shù)要求，可基于此對參芪王漿養(yǎng)血口服液中的單糖類成分進(jìn)行HPLC-IT-MS和HPLC-TOF-MS分析，為參芪王漿養(yǎng)血口服液的質(zhì)量控制提供更多參考依據(jù)。

[1] 金光日,洪海.參芪王漿養(yǎng)血口服液中10-羥基-2-癸烯酸(10-HAD)的含量測定[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2007,23(5):32-33.

[2] 羅國安,梁瓊麟,王義明.中藥指紋圖譜-質(zhì)量控制與新藥研發(fā)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2009.

[3] 肖雪,羅國安,王義明,等.中藥板藍(lán)根高效液相色譜法指紋圖譜研究[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2010,22(3):67-69.

[4] 羅娟敏,肖雪,梁瓊麟,等.丹紅注射液指紋圖譜研究[J].中成藥,2011,33(8): 1277-1290.

[5] 祖雙,梁潔,劉明穎,等.參芪王漿養(yǎng)血口服液高效液相指紋圖譜研究[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2015,11(2):19-21.

[6] 祖雙,劉黎鋒,梁潔,等.兩種相似度表征參芪王漿養(yǎng)血口服液指紋圖譜質(zhì)量研究[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥,2015,11(3):30-31.

[7] 喬善磊.中藥指紋圖譜相似度評價研究[D].上海:第二軍醫(yī)大學(xué),2004：5.

[8] 曹進(jìn),饒毅,沈群,等.中藥指紋圖譜及其建立原則[J].中藥新藥與臨床藥理,2001,12(3):200-203.

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(責(zé)任編輯：尹晨茹)

Fingerprints of Monosaccharides in Nourishing Oral Liuid of Royal Jelly, Ginseng and Astragalus Root by HPLC

Chen Zhiheng1,Ma Jinfang2,Xiao Xue2,3,Liang Jie3*,Li Shasha4*

(1.Weifang Center for Food and Drug Control, Weifang 261205,China;2.Nansha Research Institute, Sun Yat-sen University,Guangzhou 511458, China;3.Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China;4.Guangzhou Province Hospital of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China)

Objective:To study the HPLC fingerprint and to establish a sensitive and specific method for controlling the quality of Monosaccharides in Nourishing Oral Liuid of Royal Jelly, Ginseng and Astragalus Root (NOLRJGA) derived by PMP reagent.Methods:HPLC method was set up, using Phenomenex Luna RP C18(250mm×4.6mm,5μm)with gradient elution, and the mobile phase was comprised of potassium dihydrogen phosphate-buffered saline(0.1mol/L,pH=6.7) and Acetonitrile, the UV detection wavelength was at 250nm, with a flow rate of 1.0 mL/min.Results:The HPLC fingerprint was set up, and the similarity were higher than 0.85 with a total of 10 peaks as reference peaks by similarity evaluation system for chromatographic fingerprint of TCM.Conclusion:The quality of Monosaccharides in NOLRJGA can be controlled effectively by HPLC fingerprints.

Nourishing Oral Liuid of Royal Jelly;Ginseng and Astragalus Root; Monosaccharide;HPLC;Fingerprint

2015-04-16

陳志恒(1983-)，女，山東省濰坊市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心藥師，研究方向?yàn)橹兴幹苿┓治觥?/p>

李莎莎(1983-)，女，廣東省中醫(yī)院助理研究員，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量控制。梁潔(1969-)，女，廣東藥學(xué)院副教授，研究方向?yàn)槭称钒踩c中藥質(zhì)量控制。E-mail：liangjie69@126.com

R284.1

A

1673-2197(2015)22-0025-03

10.11954/ytctyy.201522010