帥麗芳，趙勇，劉文森，銀濤

（1.廣州軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心，廣東 廣州，510507；2.中山大學(xué) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，廣東 廣州510080）

近年來(lái)隨著我國(guó)工業(yè)化進(jìn)程的加速，食品安全問(wèn)題也越來(lái)越突出。目前我國(guó)生產(chǎn)和使用的殺蟲(chóng)劑絕大多數(shù)品種為有機(jī)磷，最易引起食物農(nóng)藥殘留中毒，因而對(duì)農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留的檢測(cè)尤為重要。目前有機(jī)磷農(nóng)藥殘留分析的主要方法是氣相色譜法（GC）、高效液相色譜法（HPLC）及酶抑制法，氣相、液相分析方法雖然檢測(cè)精度高，但其樣品的前處理復(fù)雜、檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)、成本高、需要技術(shù)熟練的專業(yè)人員。而酶抑制法檢測(cè)農(nóng)藥殘留方法靈敏度不高，錯(cuò)檢、漏檢較多，不能給出定量檢測(cè)結(jié)果，且檢測(cè)限普遍高于國(guó)際和國(guó)內(nèi)規(guī)定的殘留限量標(biāo)準(zhǔn)值，有待進(jìn)一步改善。免疫分析方法的原理是基于抗原與抗體間的特異性反應(yīng)對(duì)農(nóng)藥殘留進(jìn)行檢測(cè)，其特點(diǎn)是靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)快速，該方法適用于大批量樣本檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

有機(jī)磷農(nóng)藥相對(duì)分子量一般小于400，本身不具有免疫原性，必須將其與載體蛋白偶聯(lián)才具有誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體的能力。本研究選擇具有有機(jī)磷農(nóng)藥分子中共有官能團(tuán)作為目標(biāo)抗原決定簇設(shè)計(jì)通用人工抗原，進(jìn)一步制備了該共有結(jié)構(gòu)的有機(jī)磷單克隆抗體，并對(duì)所得的抗體特性進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 試材

二乙基磷酸乙酸（購(gòu)自sigma公司）、N－羥基琥珀酰亞胺（NHS）、PBS緩沖液、硼酸緩沖液（pH＝9）、細(xì)胞培養(yǎng)液、HRP標(biāo)記的羊抗鼠抗體、氯甲酸異丁酯、弗氏（不）完全佐劑、環(huán)二己基碳酰亞胺（DCC）、水溶性碳化二亞胺（EDC）、二甲基甲酰胺 （DMF）、卵 清 蛋 白 （OVA）、牛血 清 蛋 白（BSA）、四氫呋喃（THF）、甲基對(duì)硫磷、敵百蟲(chóng)、呋喃丹、氧化樂(lè)果、毒死蜱（農(nóng)藥均為國(guó)產(chǎn)分析純）、雌性BALB／c小鼠（中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 半抗原的選擇

本實(shí)驗(yàn)選擇小分子二乙基磷酸乙酸（分子量為196）為半抗原（Hapten，HAP），二乙基磷酸乙酸的結(jié)構(gòu)中包括有1個(gè)羧基、2個(gè)乙氧基以及1個(gè)磷氧基（圖1）。

圖1 二乙基磷酸乙酸Fig.1 Structure of the hapten diethylphosphonoacetic acid

1.2.2 人工抗原的制備

人工抗原的制備采用混合酸酐法（MAH），將半抗原（HAP）與BSA和OVA載體蛋白分別進(jìn)行偶聯(lián)，具體方法按參考文獻(xiàn)所述方法［1，2］，經(jīng)透析純化后，分別為免疫抗原與包被抗原。

1.2.3 人工抗原的鑒定

將偶聯(lián)好的人工抗原采用紫外分光光度計(jì)法（LANBDA 55）進(jìn)行測(cè)定。大分子與小分子偶聯(lián)物中，兩種分子均有各自不同的紫外吸收峰，但在偶聯(lián)物紫外掃描光譜中表現(xiàn)出各自光譜圖迭加的性質(zhì)。

1.2.4 免疫方案

將制備好的人工抗原（免疫抗原HAP－BSA）與等體積弗氏完全佐劑混合，用乳化器充分混勻后，皮下多點(diǎn)注射6周齡的健康BALB／c雌性小鼠，每只注射劑量為50μg（以蛋白濃度計(jì)）。第一次免疫用弗氏完全佐劑，以后每隔二周，用弗氏不完全佐劑進(jìn)行免疫，共免疫4次，融合前3d加強(qiáng)免疫1次，并檢測(cè)小鼠血清抗體效價(jià)。

1.2.5 細(xì)胞融合、篩選、克隆及亞類鑒定：

融合過(guò)程參照金仁耀等［3］的方法進(jìn)行：骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞的比例1∶5，融合過(guò)程均在無(wú)菌條件下進(jìn)行。取末次免疫后3d的小鼠脾臟，研磨、吹打，收獲用脾細(xì)胞懸液。將脾細(xì)胞懸液（約1×108個(gè)）吸入混有2×107個(gè)小鼠骨髓瘤細(xì)胞，加入BMEM進(jìn)行融合。將融合的細(xì)胞在含有HAT篩選培養(yǎng)基中選擇培養(yǎng)，以后每3～4d采用半量換液法更換HT培養(yǎng)基。篩選分泌抗體的細(xì)胞株，用有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞株做克隆化［4］，以獲得可穩(wěn)定分泌特異性單克隆抗體的單克隆雜交瘤細(xì)胞株。進(jìn)一步對(duì)雜交瘤細(xì)胞株所分泌的抗體進(jìn)行亞類鑒定［5］。

1.2.6 抗體特異性及對(duì)5種農(nóng)藥交叉反應(yīng)率測(cè)定取雜交瘤細(xì)胞注射至6周的BALB／c小鼠腹腔，2周后收集小鼠腹水，用于抗體的純化與鑒定。用PBS緩沖溶液配制濃度為0，0.01，0.10，

1.0 ，5.0，10，50和100mg·L－1的 HAP標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線，計(jì)算半抗原的半數(shù)抑制濃度IC50。將5種農(nóng)藥純品（甲基對(duì)硫磷、敵百蟲(chóng)、呋喃丹、氧化樂(lè)果和毒死蜱）作稀釋并建立各農(nóng)藥的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出5種農(nóng)藥的半數(shù)抑制濃度（IC50，衡量抗體靈敏度，半數(shù)抑制率越低，抗體靈敏度越高），并計(jì)算交叉反應(yīng)率［6］（交叉反應(yīng)率＝［IC50（二乙基磷酸乙酸）／IC50（二乙基磷酸乙酸及其他農(nóng)藥）］×100%）及最低檢測(cè)限

LOD（LOD＝B0－3SD，B0為不添加抑制物質(zhì)的對(duì)照孔的OD值，SD為標(biāo)準(zhǔn)差）

2 結(jié)果與分析

2.1 人工抗原的鑒定

通過(guò)紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)（LANBDA 55）連續(xù)波長(zhǎng)（190～400nm）掃描，偶聯(lián)物的吸收譜圖與相應(yīng)的載體蛋白相比發(fā)生明顯變化。半抗原與BSA及OVA及其偶聯(lián)物如圖2所示。

2.2 單克隆雜交瘤細(xì)胞株及單克隆抗體的制備

免疫4次后的BALB／c小鼠經(jīng)非競(jìng)爭(zhēng)性間接ELISA法［7］檢測(cè)，血清中均檢測(cè)到抗半抗原的特異性單克隆抗體，血清中抗體效價(jià)達(dá)到1∶105以上。

細(xì)胞融合后，經(jīng)HAT培養(yǎng)基篩選獲得雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)間接ELISA法檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的抗體，獲得穩(wěn)定分泌單克隆抗體的單克隆雜交瘤細(xì)胞株。

2.3 抗體鑒定

BALB／c小鼠腹水經(jīng)辛酸／硫酸銨法純化后，單克隆抗體純度達(dá)到90%以上，分子量為150kD，抗體分型試劑盒檢測(cè)抗體效價(jià)為2.48×105。

2.4 抗體特異性測(cè)定

獲得的單克隆抗體亞類鑒定為IgG1。

通過(guò)繪制間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線可算出半抗原半數(shù)抑制濃度IC50為0.34μg·mL－1（圖3）。

圖2 半抗原、偶聯(lián)物及載體蛋白的紫外掃描圖譜Fig.2 UV spectra of hapten，conjugate and carriers

圖3 半抗原的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 The standard curve of the indirect competitive ELISA about the hapten

從表1可以看出，二乙基磷酸乙酸單克隆抗體對(duì)毒死蜱、氧化樂(lè)果、敵百蟲(chóng)的交叉反應(yīng)率分別為65.39%、38.20%、35.05%，對(duì)甲基對(duì)硫磷、呋喃丹無(wú)交叉反應(yīng)。毒死蜱在結(jié)構(gòu)上也有一個(gè)C2H5O－基，與二乙基磷酸乙酸相似。氧化樂(lè)果和敵百蟲(chóng)結(jié)構(gòu)中都含有一個(gè)P＝O基和CH3O－基。

3 討論與結(jié)論

大多數(shù)農(nóng)藥的免疫化學(xué)檢測(cè)法只針對(duì)農(nóng)藥殘留檢測(cè)的需要，給農(nóng)藥的免疫化學(xué)檢測(cè)方法研究提出了新的挑戰(zhàn)。

表1 5種農(nóng)藥的半數(shù)抑制濃度（IC50）及最低檢測(cè)限（LOD）Table 1 The half inhibitory concentration （IC50）and the lowest detection limit（LOD）about the five kinds of pesticide

本實(shí)驗(yàn)制備的有機(jī)磷通用結(jié)構(gòu)抗體，目的是為了檢測(cè)有相似結(jié)構(gòu)的一類有機(jī)磷農(nóng)藥。以有機(jī)磷農(nóng)藥通用人工抗原（含有多種有機(jī)磷農(nóng)藥分子中共有官能團(tuán)R 和 R′多 為 甲 氧 基（CH3O—）或乙氧基（C2H5O－），Y 為氧（O）或硫（S）原子，X為烷基、共軛雙鍵、芳香族或其他取代基團(tuán)［4］）。作為目標(biāo)抗原決定簇，制備的單克隆抗體能識(shí)別含有這種共有結(jié)構(gòu)的一類有機(jī)磷農(nóng)藥，進(jìn)而建立可用于多殘留分析的免疫檢測(cè)法。該方法不僅保持了免疫分析法高靈敏度和高特異性的優(yōu)勢(shì)，還可突破傳統(tǒng)免疫檢測(cè)法的瓶頸，拓寬其檢測(cè)范圍，檢測(cè)其具有共性結(jié)構(gòu)的有機(jī)磷農(nóng)藥。本試驗(yàn)以二乙氧基磷酸基團(tuán)作為目標(biāo)抗原決定簇，以羧基為活性位點(diǎn)，合成并鑒定了人工抗原，通過(guò)細(xì)胞融合、克隆，篩選出了能夠穩(wěn)定分泌針對(duì)該通用結(jié)構(gòu)的單克隆抗體的細(xì)胞株，并對(duì)其性能進(jìn)行了研究。

本實(shí)驗(yàn)制備的抗體可以識(shí)別篩選具有（C2H5O－）2－P（O或S）－O結(jié)構(gòu)的幾種有機(jī)磷農(nóng)藥，在檢測(cè)的5種農(nóng)藥中，對(duì)毒死蜱、氧化樂(lè)果及敵百蟲(chóng)有較靈敏的反應(yīng)性，這對(duì)于建立有機(jī)磷酶聯(lián)免疫測(cè)定方法以及下一步研制快檢試劑盒具有重要意義。

［1］梁穎，劉媛，祝金鳳，等.甲氧苦有機(jī)磷殺蟲(chóng)劑廣譜特異性抗體的制備［J］.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，41（3）：727－733.

［2］Gendloff E H，Casale W L，Ram B P，et al.Hapten－Protein Conjugates Prepared by The Mixed Anhydride Method Cross－reactive Antibodies in Heterologous Antisera［J］.Journal of immunological methods，1986，92（1）：15－20.

［3］金仁耀，桂文君，吳建祥，等.抗毒死蜱單克隆抗體的研制［J］.浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2006，32（6）：591－597.

［4］張麗杰，潘家榮.乙氧基磷酸酯類有機(jī)磷農(nóng)藥單克隆抗體的制備與鑒定［J］.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2010，37（9）：1016－1024.

［5］吳蕓茹，王利民，婁旸，等.復(fù)合免疫制備3種有機(jī)磷農(nóng)藥單克隆抗體的技術(shù)研究［J］.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，32（4）：94－99.

［6］Leif Bruun，Claus Koch，Mogens H J，et al.A new monoclonal antibody for the sensitive detection of cyanazine and other s－triazines in water by ELISA［J］.Food and Agricultural Immunology，2000，4（12）：253－262.

［7］張奇，李鐵軍，朱曉霞，等.氨基甲酸酯類殺蟲(chóng)劑速滅威酶聯(lián)免疫吸附分析方法研究［J］.分析化學(xué)，2006，34（2）：178－182.