張?zhí)O，張?jiān)?，王慧春，王文穎﹡，徐進(jìn)﹡

（1.青海師范大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院，青海 西寧810008；2.中國(guó)科學(xué)院西雙版納熱帶植物園，云南 昆明650223；3.荒漠與綠洲生態(tài)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所，新疆 烏魯木齊830011）

MATE轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 （multidrug and toxic compound extrusion transporter）是一類多藥耐藥性家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它們的活性依賴于跨膜電化學(xué)勢(shì)提供的能量［1］。在擬南芥中至少有56個(gè)基因?qū)儆贛ATE基因，在水稻基因組中也至少發(fā)現(xiàn)了50個(gè)MATE基因［2］。MATE家族在植物中的序列多樣性以及表達(dá)模式的差異，決定了它們的功能差異性。最初發(fā)現(xiàn)，MATE家族的基因在細(xì)胞解毒機(jī)制中起重要作用。近年來發(fā)現(xiàn)，該家族基因在植物響應(yīng)重金屬毒害過程中也可能發(fā)揮重要作用［3］。

當(dāng)今世界，重金屬污染對(duì)農(nóng)業(yè)和人類生活帶來的影響日趨嚴(yán)重。一些重金屬元素如Cu、Fe、Mn、Mo、Ni和Zn是植物的必需元素，缺乏這些元素會(huì)導(dǎo)致作物減產(chǎn)［4，5］，然而，濃度過高時(shí)則對(duì)植物造成傷害。Zn主要來源于采礦、電鍍和冶煉行業(yè)污染物的排放。土壤中Zn超過200mg·kg－1時(shí)則可能對(duì)植物生長(zhǎng)造成危害，過量Zn可以直接導(dǎo)致植物發(fā)生Zn中毒［6］。研究植物對(duì)Zn吸收、運(yùn)輸和累積的生理與分子機(jī)理，鑒定植物中的Zn轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，對(duì)于我們利用生物技術(shù)手段培育Zn高效利用作用，以及植物修復(fù)技術(shù)均有重要的意義。高粱是一種重要的能源經(jīng)濟(jì)作物，具有較高的重金屬耐受性。為分離鑒定高粱中Zn響應(yīng)的基因，我們通過深度測(cè)序技術(shù)，分析了高粱根系中差異表達(dá)的基因，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)顯著受Zn缺乏誘導(dǎo)的MATE家族基因SbMATE。我們利用酵母功能互補(bǔ)試驗(yàn)對(duì)該基因的功能進(jìn)行了初步分析，為進(jìn)一步探明該基因在植物Zn吸收和Zn毒害耐受中的功能奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

植物材料高粱品種BTx623由中科院景海春研究員饋贈(zèng)。酵母菌株YK44（ura3－52his3－200，ΔZRC，ΔCot1，mating typeα）為 Zn／Cd／Ni／Co敏感型，受贈(zèng)于德國(guó)Dietrich H.Nies教授。穿梭表達(dá)載體pYES2帶有GAL1啟動(dòng)子，用于在酵母中高效表達(dá)SbMATE。

1.2 方法

1.2.1 SbMATE基因的克隆、測(cè)序及同源性分析

通過高通量的差異基因表達(dá)分析測(cè)序技術(shù)（DGE技術(shù)），我們鑒定了高粱根系中Zn缺乏下差異表達(dá)的基因，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)MATE家族基因Sb04g031980顯著受Zn缺乏的誘導(dǎo)，故命名為SbMATE。在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源核苷酸檢索，并進(jìn)行蛋白質(zhì)同源性比較，通過Treeview進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。測(cè)序和引物合成由上海生工和北京中美泰和公司完成。

1.2.2 酵母菌株、質(zhì)粒及酵母表達(dá)載體的構(gòu)建

以HindIII／BamHI為酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，分別 構(gòu) 建 pYES2－SbMATE 和 pYES2－SbMATEGFP穿梭表達(dá)載體。并構(gòu)建pYES2－GFP穿梭表達(dá)載體作為基因在酵母中亞細(xì)胞定位的對(duì)照。

采用醋酸鋰法轉(zhuǎn)化酵母菌株YK44，通過尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基篩選陽(yáng)性克隆，并通過菌落PCR進(jìn)行鑒定。

在YPD培養(yǎng)基 （1%酵母浸提液、2%蛋白胨、2%葡萄糖，pH5.8）中添加響應(yīng)濃度的重金屬，進(jìn)行脅迫處理試驗(yàn)。

1.2.3 酵母細(xì)胞中SbMATE亞細(xì)胞定位

將 轉(zhuǎn) 化 pYES2－SbMATE－GFP 和 pYES2－GFP穿梭表達(dá)載體的酵母YK44陽(yáng)性菌株，在激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP熒光，分析SbMATE在酵母細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位情況。

1.2.4 酵母重金屬耐受試驗(yàn)

YK44－pYES2、YK44－pYES2－ SbMATE 在SD－ura培養(yǎng)基中培養(yǎng)生長(zhǎng)1d，OD600達(dá)到0.2，取100uL培養(yǎng)物接種到10mL SD－ura（2%半乳 糖）＋ CdCl2（0.01～0.05mmol·L－1）或ZnCl2（0.04～0.20mmol·L－1）或者CoCl2（0.1～0.5mmol·L－1）的含有不同濃度的重金屬的培養(yǎng)基中，30℃，250r·min－1，培養(yǎng)36h后測(cè)定600 nm吸光值，試驗(yàn)取3個(gè)酵母陽(yáng)性克隆，每個(gè)克隆做3個(gè)重復(fù)，取平均值并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤差。

2 結(jié)果和分析

2.1 高粱SbMATE基因的克隆與相似性分析

為了分離和鑒定高粱中Zn響應(yīng)的基因，通過深度測(cè)序技術(shù)，我們分析了高粱根系中差異表達(dá)的基因，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)受Zn缺乏顯著誘導(dǎo)的MATE家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因Sb04g031980。序列分析表明，該片段長(zhǎng)1 704bp，經(jīng)DNAman軟件分析，證明該序列編碼了一個(gè)完整的讀碼框（圖1），含有一個(gè)1 704bp的ORF，編碼一個(gè)由567個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，分子量53.9kD。其蛋白含有兩個(gè)MATE結(jié)構(gòu)域，分別位于88～248bp和310～472bp處。我們將該基因命名為SbMATE。

MATE在生物體的生命活動(dòng)中起著重要的作用，其結(jié)構(gòu)和功能非常保守。將SbMATE（Sb04g031980）編碼區(qū)序列經(jīng)GenBankBlast比對(duì)后，發(fā)現(xiàn)與大多數(shù)高等植物MATE，如玉米、粟等同源性都很高，大于90%。其編碼蛋白質(zhì)一級(jí)序列更顯示了其蛋白質(zhì)的保守性，ClustalW分析（圖2）顯示該蛋白質(zhì)與玉米GRMZM2G135175和小米Si016794m編碼的蛋白質(zhì)在其兩個(gè)MATE結(jié)構(gòu)域內(nèi)同源性高于98%。在高粱的MATE家族中進(jìn)化關(guān)系如圖3所示，SbMATE（Sb04g031980）與另一個(gè) MATE家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Sb06g025870位于同一個(gè)分支上。

圖1 高粱SbMATE（Sb04g031980）基因及編碼蛋白Fig.1 Gene and protein sequences of SbMATE（Sb04g031980）

圖2 高粱MATE基因編碼的氨基酸序列與其他植物MATE基因編碼氨基酸序列比較Fig.2 Comparative analysis of protein sequence of SbMATE and their plant MATEs

圖3 高粱MATE蛋白質(zhì)序列系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of Sorghum MATE protein

2.2 pYES2－SbMATE 和 pYES2－SbMATE－GFP表達(dá)載體的構(gòu)建、酵母轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性克隆的篩選

為了進(jìn)一步研究SbMATE在酵母細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位，以及在重金屬脅迫下的作用，將Sb－MATE經(jīng)HindIII／BamHI雙酶切后，插入pYES2的PGAL1之后，構(gòu)建酵母表達(dá)載體pYES2－SbMATEGFP和pYES2－SbMATE，轉(zhuǎn)化酵母。載體信息如圖4，通過PCR分析鑒定陽(yáng)性克隆，確認(rèn)載體構(gòu)建成功。

圖4 pYES2－SbMATE、pYES2－SbMATE－GFP 和pYES2－GFP 表達(dá)載體圖譜Fig.4 Vector profile of pYES2－SbMATE，pYES2－SbMATE－GFPand pYES2－GFP

2.3 SbMATE在酵母細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位分析

利用 YK44－pYES2－SbMATE－GFP轉(zhuǎn)基因酵母細(xì)胞，我們對(duì)SbMATE在酵母中的亞細(xì)胞定位進(jìn)行了觀察。如圖5所示，SbMATE蛋白定位在酵母細(xì)胞的液泡中。

圖5 SbMATE在酵母細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位觀察Fig.5 Subcellular localization of SbMATE in yeast cell

2.4 轉(zhuǎn)SbMATE基因酵母重金屬耐性分析

以轉(zhuǎn)空載體pYES2的酵母為對(duì)照，分別用不同濃度的Zn、Co、Ni、Cd脅迫處理SbMATE轉(zhuǎn)基因酵母菌株。如圖6，結(jié)果表明，半乳糖誘導(dǎo)下，所有測(cè)試濃度的Ni、Co和Cd處理下的SbMATE轉(zhuǎn)基因酵母生長(zhǎng)狀況均與對(duì)照差異不顯著。但在0.05～0.10mmol·L－1ZnCl2處理下，SbMATE轉(zhuǎn)基因酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況明顯優(yōu)于對(duì)照酵母細(xì)胞。這表明，SbMATE的過表達(dá)增強(qiáng)了酵母細(xì)胞對(duì)Zn毒害的耐受性。

圖6 SbMATE在酵母細(xì)胞中的重金屬耐性分析Fig.6 Heavy metal tolerance analysis of SbMATEin yeast cells

3 結(jié)論與討論

最初發(fā)現(xiàn)，MATE家族基因在細(xì)胞解毒機(jī)制中起重要作用。例如，最早鑒定出的擬南芥MATE家族基因ALF5（At3g23560）是一個(gè)四甲銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白［1］；而TT12（At3g59030）則編碼一個(gè)類黃酮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，該基因特異性地表達(dá)在胚珠和發(fā)育中的種子，將類黃酮轉(zhuǎn)運(yùn)至種子內(nèi)表皮的液泡中［2］。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，MATE家族中的一些蛋白在重金屬離子的吸收、運(yùn)輸和累積中發(fā)揮重要作用。如FRD3（At3g08040）在根中特異性表達(dá)，該基因在根的木質(zhì)部裝載Fe螯合物，從而將Fe運(yùn)輸至地上部葉片中［3］。水稻MATE蛋白屬于檸檬酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，研究發(fā)現(xiàn)，OsFRDL4受到Al的顯著誘導(dǎo)，參與了植物對(duì)Al毒害的耐受性。在高粱中還發(fā)現(xiàn)一個(gè)MATE轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AltSB，在高粱對(duì)Al毒害的耐受性中也發(fā)揮著重要作用［7～10］。本研究從高粱Zn缺乏響應(yīng)的差異表達(dá)的基因中獲得了一個(gè)MATE家族基因SbMATE，通過GFP亞細(xì)胞定位研究發(fā)現(xiàn)，該基因定位在酵母細(xì)胞的液泡中。通過酵母重金屬耐性分析研究發(fā)現(xiàn)，該基因增加了YK44酵母細(xì)胞對(duì)Zn毒害的耐受性，表明該基因在重金屬耐受和累積過程中可能發(fā)揮重要作用。我們推測(cè)，定位于酵母液泡的SbMATE蛋白，可能通過將Zn吸收進(jìn)酵母液泡中，從而降低了過量的Zn對(duì)細(xì)胞的毒害，因而提高了酵母細(xì)胞的耐受性。在今后的研究中，我們將進(jìn)一步檢測(cè)酵母細(xì)胞中的Zn含量，并在植物中通過構(gòu)建過表達(dá)和抑制表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株，驗(yàn)證該基因在植物Zn毒害和Zn缺乏響應(yīng)中的功能。

［1］Diener AC，Gaxiola RA，F(xiàn)ink GR.Arabidopsis ALF5，a multidrug efflux transporter gene family member，confers resistance to toxins［J］.Plant Cell，2001，13（7）：1625－1638.

［2］Debeaujon I，Peeters AJ，Leon－Kloosterziel KM，et al.The Transparent Testa 12 gene of Arabidopsis encodes a multidrug secondary transporter－like protein required for flavonoid sequestration in vacuoles of the seed coat endothelium ［J］.Plant Cell，2001，13（4）：853－871.

［3］喻絲絲，魏林艷，謝華安，等.MATE轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在水稻抗逆作用中的研究進(jìn)展［J］.福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，29（4）：398－405.

［4］張玉秀，徐進(jìn)，王校，等.植物抗旱和耐重金屬基因工程研究進(jìn)展［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2007，18（7）：1631－1639.

［5］王志香，周光益，吳仲民，等.植物重金屬毒害及其抗性機(jī)理研究進(jìn)展［J］.河南林業(yè)科技，2007，27（2）：1003－2630.

［6］項(xiàng)長(zhǎng)興，董雅文，錢君龍，等.南京棲霞山鉛鋅礦區(qū)土壤環(huán)境質(zhì)量評(píng)價(jià)［J］.土壤，1993，25（6）：319－322.

［7］Magalhaes JV，Liu J，Guimar?es CT，et al.A gene in the multidrug and toxic compound extrusion（MATE）family confers aluminum tolerance in sorghum ［J］.Nat Genet，2007，39（9）：1156－1161.

［8］Xu J，Sun JH，Du LG，et al.Comparative transcriptome analysis of cadmium responses in Solanum nigrumand Solanum torvum ［J］.New Phytol，2012a，196：110－124.

［9］Xu J，Zhu YY，Ge Q，et al.Comparative physiological responses of Solanum nigrumand Solanum torvumto cadmium stress［J］.New Phytol，2012b，196：125－138.

［10］Shi DQ，Zhang Y，Ma JH，et al.Identification of Zinc Deficiency－Responsive MicroRNAs in Brassica juncea Roots by Small RNA Sequencing［J］.J Integrative Agriculture，2013，12（11）：2036－2044.