劉振亞 熊仁次 朱天生

(塔里木大學植物科學學院， 新疆 阿拉爾 843300)

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鏈格孢屬小孢子種總DNA提取方法的比較

劉振亞 熊仁次 朱天生*

(塔里木大學植物科學學院， 新疆 阿拉爾 843300)

本研究采用液氮研磨法和石英砂研磨法對鏈格孢屬小孢子種總DNA進行提取，并通過超微量分光光度計檢測DNA的純度和濃度及通過瓊脂糖凝膠電泳和PCR檢測DNA的質(zhì)量，以期篩選出適合鏈格孢屬小孢子種總DNA提取的方法。結(jié)果表明，兩種方法均可得到鏈格孢屬小孢子種的DNA，并且兩種方法提取基因組DNA的效果無明顯的區(qū)別。其中，液氮研磨法需要較多的菌絲體、所需時間長、成本高、獲取液氮不易，而石英砂研磨法簡單快速、時間短、成本低、研磨充分，損失少、可以避免使用液氮等優(yōu)點。因此，石英砂研磨法是鏈格孢屬小孢子種用于病原種類研究所需總DNA提取的較為理想的方法。

鏈格孢屬小孢子種； DNA提?。?石英砂研磨法； 液氮研磨法

棗屬鼠李科(Rhamnaceae)棗屬(ZizyphusMill.)植物[1]，棗樹對氣候、土壤的適應能力很強，耐土壤干旱、鹽堿和貧瘠，已成為新疆南疆各地防風固沙的經(jīng)濟林樹種，而紅棗產(chǎn)業(yè)已成為南疆特色支柱產(chǎn)業(yè)，帶動了當?shù)氐木蜆I(yè)和經(jīng)濟發(fā)展，將進一步改善邊疆社會穩(wěn)定現(xiàn)狀。近幾年隨著紅棗進入豐產(chǎn)期，與Alternariaspp.有關(guān)的棗果黑斑病、縮果病等鏈格孢屬小孢子種引起的病害發(fā)生越來越嚴重，造成了較大的經(jīng)濟損失，而目前有關(guān)這些病害的報道中病原種類較為混亂和不確定，給該類病害的防治工作帶來一定的困難。本研究擬對南疆地區(qū)密植棗園的棗果和棗葉上的病原菌通過形態(tài)學鑒定結(jié)合分子鑒定的方法進行準確鑒定，而鏈格孢屬小孢子種DNA的提取是本研究的前提，因此篩選出高效快速的DNA提取方法，對鏈格孢屬病原菌的準確鑒定具有重要的意義。目前報道中多采用CTAB法提取鏈格孢屬病原菌的DNA，于麗娜[2]用CTAB法提取冬棗黑點病病原菌的DNA,經(jīng)PCR擴增，通過ITS基因序列分析結(jié)合形態(tài)學鑒定，確定冬棗黑點病病原菌為Alternariaalternata(Fr.)Keissler。于占晶[3]等用CTAB法提取壺瓶棗褐斑病病原菌的DNA，采用通用引物ITS1和ITS4、特異性引物AAF2和AAR2以及Aalt-F和Aalt-R進行PCR擴增，通過三個基因序列分析結(jié)合形態(tài)學鑒定，確定壺瓶棗褐斑病的病原菌為A.alternata(Fr.)Keissler。王志霞[4]用CTAB法獲取紅棗葉斑病病原菌的DNA，使用病原菌的rDNA-ITS、EF1-α、β-tubulin基因進行PCR擴增，通過三個基因序列分析結(jié)合形態(tài)學鑒定，確定紅棗葉斑病的病原菌為A.alternata(Fr.)Keissler、Fusariumoxysporum(Schlecht.) 和F.equiseti。袁洪水[5]在提取頂頭孢霉DNA時發(fā)現(xiàn)，使用液氮研磨法，研磨強度不夠時，不利于染色體DNA的充分釋放,但研磨過于激烈會導致染色體DNA的斷裂，而石英砂研磨法提取DNA是利用石英砂為介質(zhì)對真菌細胞進行研磨破壁,能使染色體DNA充分釋放,又可以通過控制研磨時間及研磨力度確保染色體DNA的完整性。目前還沒有關(guān)于使用石英砂研磨法提取鏈格孢屬小孢子種總DNA的報道。因此，本研究采用液氮研磨法和石英砂研磨法2種方法，對6種鏈格孢屬小孢子種進行DNA提取比較研究，并采用通用引物和特異性引物對提取的DNA進行PCR擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳和PCR擴增檢測DNA的質(zhì)量，篩選出適合鏈格孢屬小孢子種總DNA提取的方法，為鏈格孢屬病原菌的準確鑒定奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種的培養(yǎng)和收集

實驗所用的6種鏈格孢屬小孢子種由本實驗室(塔里木大學南疆農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點實驗室)分離、純化并保存。

將菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)5天，使用打孔器打取菌餅轉(zhuǎn)接到含有100mLPD的錐形瓶中，置于28℃、轉(zhuǎn)速為180r/min的搖床中，培養(yǎng)2-3天后，用無菌水沖洗，四層滅菌的紗布過濾，40℃烘干后放入滅菌EP管中備用。

表1 鏈格孢屬小孢子種編號

1.2 DNA提取方法

1.2.1 液氮研磨法

參照劉娟[6]的方法，并略做改進。稱取0. 2g的菌絲體加入液氮快速研磨成粉后，裝入離心管中，加入600μL預熱1h的CTAB,充分混勻，65 ℃水浴1h，在水浴期間，每隔15min輕搖一次，加入等體積的酚：氯仿：異丙醇(25:24:1)，輕搖10min，8 000rpm離心10min,取上清液，加入等體積的氯仿：異丙醇(24:1), 輕搖10min，13 000rpm離心10min后，取上清液，加入0. 1倍的3mol/L醋酸鈉和等體積的異丙醇(醋酸鈉和異丙醇提前放在-20 ℃冰箱中預冷)，小心的反轉(zhuǎn)離心管將液體混合均勻后，置-20 ℃冰箱中沉淀2h，13 000rpm離心5min，收集沉淀，用500μL冷凍的70%的酒精洗滌沉淀2次，無水乙醇沖洗1次，最后在室溫條件下干燥，在無水乙醇揮發(fā)干凈后，向離心管中加入100μLTE(PH8. 0),4 ℃放置過夜，使DNA充分溶解，待DNA充分溶解后，向其中加入1μL10mg/mLRNase，37 ℃水浴2h[7]，使RNA完全降解。

1.2.2 石英砂研磨法

參照夏花[8]的方法，并做改進。稱取0. 1g的菌絲體，加入一定量的CTAB和適量的石英砂研磨充分，取研磨液于1. 5mL的離心管中，65 ℃水浴20min，加入600μL7. 5mol/LNaCl溶液，充分混勻后，冰浴10min，13 000rpm離心5min，取上清液到新的離心管中，加入等體積的氯仿：異丙醇(24:1), 輕搖10min，13 000rpm離心5min后，加入加入0. 1倍的3mol/L醋酸鈉和2倍體積的無水乙醇(醋酸鈉和無水乙醇提前放在-20 ℃冰箱中預冷)，13 000rpm離心5min，收集沉淀，用500μL冷凍的70%的酒精洗滌沉淀2次，待乙醇揮發(fā)后，向離心管中加入100μLTE(PH8. 0),4 ℃放置過夜，使DNA充分溶解，待DNA充分溶解后，向其中加入1μL10mg/mLRNase，37 ℃水浴2h，使RNA完全降解。

1.3 DNA質(zhì)量檢測

1.3.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA

取3μL的DNA樣品與6μL6×LoadingBuffer混合均勻后上樣，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,電泳緩沖液為1×TAE,恒定電壓為80V，電泳為30min，電泳結(jié)束后，在紫外凝膠成像儀上觀察并照相。

1.3.2 超微量分光光度計檢測DNA質(zhì)量測定

使用NanoDrop2000超微量分光光度計檢測基因組DNA的純度和濃度。

1.3.3PCR檢測

基因組DNA-ITS的PCR檢測：真菌的通用引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，ITS1: 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’,ITS4: 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。PCR反應體系25μL[9]：10×PCR反應緩沖液2. 5μL、MgCl2(25mmol/L)1. 5μL、dNTPs(10mmol/L)0. 2μL、ITS1(10μmol/L)1μL、ITS4(10μmol/L)1μL、Taq酶(5u/μL)0. 125μL、模板DNA1μL。擴增程序:94 ℃預變性2min，94 ℃1min,55 ℃30s,72 ℃1min，35個循環(huán)，72 ℃延伸10min。

基因組DNA-ATP的PCR檢測：真菌特異性引物由上海生工生物工程股份有限公司合成ATPDF1:5’-ATCGTCTCCATGACCGAGTTCG-3’,ATPDR1:5’-TCCGATGGAGTTCATGATAGCC-3’。PCR反應體系25μL：10×PCR反應緩沖液2. 5μL、MgCl2(25mmol/L)1. 5μL、dNTPs(10mmol/L)0. 2μL、ATPDF1(10μmol/L)1μL、ATPDR1(10μmol/L)1μL、Taq酶(5u/μL)0. 3μL。擴增程序:94℃預變性3min，94℃30s，59℃30s, 72℃1min，35個循環(huán)，72℃延伸5min。PCR擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 鏈格孢屬小孢子種總DNA電泳檢測結(jié)果

經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，采用兩種方法提取的鏈格孢屬小孢子種基因組DNA均比較完整，且條帶單一，蛋白質(zhì)和多糖污染較少，無拖尾現(xiàn)象和無明顯的RNA條帶。從圖可知，石英砂研磨法提取的DNA條帶明亮，但帶型細，而液氮研磨法提取的DNA帶型較寬，但條帶較暗。因此，僅通過電泳檢測無法判斷兩種方法提取的DNA含量的高低，還需通過超微量分光光度計檢測DNA的純度和濃度。

2.2 超微量分光光度計檢測DNA的純度和濃度

純DNA的A260/A280的比值是1. 8，大于1. 9，表明有RNA污染，小于1. 6，表明有蛋白質(zhì)、酚類等污染[10]。從表2數(shù)據(jù)可知，兩種方法提取的基因組DNA的A260/A280的比值均大于1. 9，說明基因組DNA中無蛋白質(zhì)、酚類等污染，但含有少量的RNA污染。從圖表中的A260/A280的比值和DNA濃度可知，兩種方法提取鏈格孢屬小孢子種總DNA的效果沒有顯著的差異。

2.3 PCR檢測DNA的質(zhì)量

采用鏈格孢屬小孢子種的通用引物和特異性引物對提取基因組DNA的質(zhì)量進行檢測，結(jié)果表明通用引物ITS1和ITS4的擴增產(chǎn)物的分子量在500～700bp之間, 特異性引物ATPDF1和ATPDR1 擴增產(chǎn)物的分子量在1 000～2 000bp之間，兩對引物擴增產(chǎn)物的分子量與預期結(jié)果一致，且均能擴增出單一、明亮、清晰的目的條帶，并具有較好的特異性。兩種方法提取的基因組DNA擴增效果相仿，均能滿足PCR擴增的要求。

圖1 液氮研磨法 圖2 石英砂研磨法

表2 DNA提取效果

圖3 液氮研磨法提取DNA的ITS-PCR圖譜 圖4 石英砂研磨法提取DNA的ITS-PCR圖譜 圖5 液氮研磨法提取DNA的ATP-PCR圖譜 圖6 石英砂研磨法提取DNA的ATP-PCR圖譜

注：圖3-6中的泳道1-6分別是6種不同的鏈格孢屬小孢子種、CK為陰性對照、M為Maker2000

3 結(jié)論與討論

基因組DNA的提取是真菌分子生物學中最基礎(chǔ)的一項技術(shù)，快速高效提取質(zhì)量高的DNA對后續(xù)試驗有重要的意義。目前國內(nèi)外報道真菌DNA提取的方法有CTAB法、SDS法[11]、蛋白酶K法[12]以及氯化芐法[13]等，不同方法的區(qū)別主要在于對細胞壁的破壁方式以及破壁后分離核酸、蛋白質(zhì)方面上的不同，常用的破壁方式有:液氮凍融、-70 ℃凍融、酶消解、超聲破碎、高鹽溶液、尿素緩沖液處理[14]等，核酸分離包括經(jīng)典的酚、氯仿抽提，以及商品化的純化柱純化膜分離法等[15]。

本文利用液氮研磨法和石英砂研磨法均能獲得鏈格孢屬小孢子種總DNA，通過分析比較兩種方法提取的DNA效果無明顯的差異，提取的DNA均能滿足后續(xù)試驗的需要。但液氮研磨法需要較多的菌絲體，增加了提取DNA的成本，同時使用液氮也有一定的危險性，而與液氮研磨法相比，石英砂研磨法具有如下優(yōu)點：(1)避免使用費用和危險性都較高的液氮，此法為獲取液氮不易的地方帶來方便；(2)可以控制研磨時間和力度，避免浪費提取材料和避免對DNA造成損傷；(3)簡單快速、時間短、成本低、安全可靠。因此，石英砂研磨法是鏈格孢屬小孢子種用于病原種類研究所需總DNA提取的較為理想的方法。

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Comparing Total DNA Extraction Method onAlternariaSmall-sporedSpecies

Liu Zhenya Xiong Renci Zhu Tiansheng*

(College of Plant Science, Tarim University, Alar, Xinjiang 843300)

Two extraction methods, quartzite sand grind and liquid nitrogen grind were applied to extract the genomic DNA fromAlternariasmall-sporedspecies,ThepurityandconcentrationofDNAwasdetectionedbyultramicrospectrophotometerandthequalityofDNAwasevaluatedwithagarosegelelectrophoresisandPCRamplification,inordertoscreenthesuitableDNAextractionmethodforAlternariasmall-sporedspecies.TheresultindicatedthatallofthetwomethodscouldobtaintheDNAandnosignificantdifferencebetweentwomethodsofextractingDNAeffect.Comparingthetwomethods,liquidnitrogengrindneedmoremycelia,longertimeandmoreexpensive,whilequartzitesandgrindingmethodwassimpleandfast,shorttime,inexpensive,andavoidedusingliquidnitrogen,whichwasadaptedtoDNAextractionofAlternariasmall-sporedspecies.

Alternariasmall-sporedspecies;DNAextraction;quartzitesandgrindingmethod;liquidnitrogengrindingmethod

2014-10-13

新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團產(chǎn)學研重大合作科技專項(2013AA001-1)；北京市援助和田科技攻關(guān)項目(201106)。

劉振亞(1987-)，男，在讀碩士，研究方向為果樹病理學。 E-mail:liuzhenya_sm@126.com

E-mail:ztszky@163.com

1009-0568(2015)02-0094-06

S432.1

A

10.3969/j.issn.1009-0568.2015.02.018