王麗君 王 楠 陳 偉

(塔里木大學生命科學學院/新疆生產建設兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室， 新疆 阿拉爾 843300)

?

南疆地區(qū)特色植物對乳房鏈球菌生物膜形成的影響

王麗君 王 楠 陳 偉*

(塔里木大學生命科學學院/新疆生產建設兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室， 新疆 阿拉爾 843300)

為了探索新疆奶牛乳房炎的防治方法，從病原菌生物膜形成角度出發(fā)，采用微孔板半定量法檢測了南疆地區(qū)三種特色植物(苦豆子、鹽穗木和醉馬草)水煎液對乳房鏈球菌生物膜形成能力的影響。結果表明，低濃度(苦豆子0. 05%～1. 6%；鹽穗木0. 05%～0. 8%；醉馬草0. 05%～3. 2%)的三種水煎液均能夠在不影響菌株生長的情況下對生物膜形成能力有明顯抑制作用。高濃度時(苦豆子和鹽穗木3. 2%；醉馬草6. 4%)則表現(xiàn)為在弱抑制菌株生長的情況下促進生物膜形成。

乳房鏈球菌； 生物膜； 南疆特色植物

新疆有著得天獨厚的發(fā)展奶牛養(yǎng)殖業(yè)的優(yōu)勢[1]。然而，奶牛乳房炎這一疾病已嚴重影響了奶牛業(yè)的經濟效益。奶牛乳房炎包括臨床型和隱性型兩種[2]，輕者引起牛奶的品質發(fā)生改變，產奶量下降，重者使奶牛失去利用價值而被淘汰。因此，預防和治療奶牛乳房炎是各國 學者研究的熱點。筆者前期研究表明在引起南疆地區(qū)奶牛隱性乳房炎的病原菌中鏈球菌占33%以上，是導致本地區(qū)奶牛隱性乳房炎的主要病原菌之一，而乳房鏈球菌占所分離鏈球菌的比例高達70%[3]，因此可以認為乳房鏈球菌是造成本地區(qū)奶牛發(fā)病的主要致病菌之一。乳房鏈球菌多樣性較為復雜[4]。新疆地區(qū)獨特的地理及氣候條件，其乳房鏈球菌的遺傳多樣性更為復雜多樣[5]，這為本地區(qū)奶牛乳房炎的防制增加了難度。

目前控制乳房炎最為普遍的方法是抗生素療法[6]，但抗生素治療容易使菌株產生耐藥性，使奶牛乳房炎的治療困難增加。近期研究發(fā)現(xiàn)，絕大多數引起慢性炎癥的病原菌是以生物膜(biofilm)的形式生長[7]，而目前用抗生素治療奶牛乳房炎的方案針對的是游離狀態(tài)的細菌。有資料顯示，抗生素濃度的選擇不當還可能會促進細菌形成生物膜[8]。近期，利用植物有效成分防治奶牛乳房炎逐漸引起了人們的重視。植物藥物還有抑菌、消炎、毒副作用小、無殘留等諸多優(yōu)點，被視為治療奶牛乳房炎較為理想的方法[9]。有學者用醉馬草、苦豆子、甘草等南疆特色植物，對分離自患乳房炎奶牛乳樣的葡萄球菌進行了影響生物膜形成的研究，結果發(fā)現(xiàn)一定濃度的醉馬草和苦豆子水煎液在不影響表皮葡萄球菌生長的情況下對其生物膜形成有明顯的抑制作用[10]，鹽穗木和甘草水煎液通過抑制金黃色葡萄球菌的生長而抑制生物膜的形成[11]，其機制尚在進一步研究中。

本研究檢測了南疆地區(qū)三種特色植物對乳房鏈球菌生物膜形成能力的影響，為從抗生物膜形成角度探索奶牛乳房炎防制新策略及尋找更有效的防治藥物提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

表皮葡萄球菌生物膜形成陽性菌株ATCC35984由新疆生產建設兵團塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室提供；乳房鏈球菌試驗菌株(SU01)分離自某奶牛場[3]。

1.1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

細菌瓊脂粉(BacterialAgar)、牛腦心浸出液(BrainHeartInfusion,BHI)、37℃培養(yǎng)、脫脂奶粉、特色植物(苦豆子，鹽穗木，醉馬草)的地上部分。

1.1.3 主要儀器及試劑

Biolog全自動微生物鑒定儀，電熱恒溫干燥箱(DHG-9031A)，96孔板(Costar)，培養(yǎng)箱(MHP-250)，超凈工作臺(SW-CT-2F)，高壓蒸汽滅菌鍋(HIRAYAMAHVE-50)，0.5%草酸銨結晶紫染液，Galanz微波爐WD700A。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳房鏈球菌的培養(yǎng)

將甘油凍存管中保存的乳房鏈球菌劃線接種于BHI固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24h后，挑取單菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)過夜。

1.2.2 生物膜實驗

根據Christensen等[12]的方法并略做改動。吸取“1.2.1”培養(yǎng)的菌液2μL，接種至加有200μLBHI+0. 5%牛奶培養(yǎng)基的96孔細胞培養(yǎng)板中，每株接種5孔。每一培養(yǎng)板同時設空白對照(等體積的空白培養(yǎng)基)各3孔。37℃恒溫靜置培養(yǎng)36h后，用酶標儀測定波長590nm處的OD值，重復3次，輕輕拍出培養(yǎng)液，用自來水洗板，以洗去未黏附細菌。56 ℃固定1h后，用質量分數為0. 5%結晶紫50μL染色5min，自來水沖洗除去多余染液，37 ℃晾干，用微生物鑒定儀測定波長490nm處的OD值，重復3次。將所得數據用Graphpadprism5軟件進行處理分析。

1.2.3 植物水煎液的制備

將所采集的植物打碎成直徑約1mm大小的顆粒，稱取100g至瓷量杯中，并加入一定量的ddH2O(水浸過液面2～3cm)，浸泡30min，大火煮開，文火熬20min，紗布過濾水煎液，濾渣再進行同樣處理，合并兩次水煎液。115℃滅菌15min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 不同濃度水煎液對乳房鏈球菌生物膜形成的影響

在含有BHI+0. 5%牛奶液體培養(yǎng)基的96孔細胞培養(yǎng)板中分別加入不同濃度的水煎液(51. 2%，25. 6%，12. 8%，6. 4%，3. 2%，1. 6%，0. 8%，0. 4%，0. 20%，0. 10%，0. 05%，0%)稀釋菌液200μL，按"1.2.2”所述檢測生物膜形成。

2 結果與分析

2.1 不同濃度植物水煎液對乳房鏈球菌SU01菌株生物膜形成能力的影響

2.1.1 不同濃度苦豆子水煎液對SU01菌株的影響

采用微孔板半定量法檢測苦豆子水煎液對臨床分離株SU01生物膜形成能力的影響。從圖1可以看出，當苦豆子水煎液濃度在0. 05%～0. 2%及0. 8%～1. 6%兩個范圍內時，能在不影響細菌生長的情況下明顯抑制生物膜形成(P<0. 05)，但0. 4%與大于3. 2%的濃度能明顯增強生物膜形成能力(P<0. 05)。由此得出結論：苦豆子水煎液在低濃度下(0. 05%～1. 6%)能夠較好地抑制乳房鏈球菌生物膜形成，在高濃度下(>3. 2%)能明顯促進生物膜的形成。

圖1 不同濃度苦豆子對SU01生物膜形成能力的影響

2.1.2 不同濃度鹽穗木水煎液對SU01菌株的影響

用96孔板檢測鹽穗木水煎液對乳房鏈球菌SU01生物膜形成能力的影響。從圖2可以看出，0. 05%～0. 8%的鹽穗木水煎液能在不影響細菌生長的情況下明顯抑制生物膜形成(P<0. 05)，隨濃度增加生物膜形成能力逐漸增強，3. 2%的濃度表現(xiàn)為促進生物膜的形成。由此可得結論：低濃度(0. 05%～0. 8%)的鹽穗木水煎液對乳房鏈球菌生物膜的形成具有較強的抑制作用，高濃度時(3. 2%)抑制作用減弱，甚至能夠促進生物膜的形成。

圖2 不同濃度鹽穗木對SU01生物膜形成能力的影響

2.1.3 不同濃度醉馬草水煎液對SU01菌株的影響

采用微孔板半定量法檢測醉馬草水煎液對SU01生物膜形成的影響。結果如圖3顯示，醉馬草水煎液濃度從0. 05%到3. 2%時均是在不影響菌株生長的情況下明顯抑制生物膜的形成(P<0. 05)，但當濃度高于6. 4%時則表現(xiàn)為促進生物膜的形成。

圖3 不同濃度醉馬草對SU01生物膜形成能力的影響

綜上所述：不同濃度的苦豆子、鹽穗木和醉馬草水煎液均是在低濃度下(苦豆子0. 05%～1. 6%；鹽穗木0. 05%～0. 8%；醉馬草0. 05%～3. 2%)不影響菌株生長但對生物膜的形成表現(xiàn)為較強的抑制作用，隨著水煎液濃度的增加，對生物膜形成抑制作用減弱，甚至促進生物膜的形成。

3 討論

一直以來，人們對新疆特色植物苦豆子、醉馬草和鹽穗木的利用率很低，為了對這三種植物的藥用功能進行探索，促進新疆特色植物的開發(fā)和利用，本實驗研究這些特色植物水煎液對乳房鏈球菌生物膜形成能力的影響，以期為新疆農牧業(yè)生產提供幫助。

苦豆子是豆科槐屬野生草木植物，含有20余種生物堿，大量研究表面，苦豆子生物堿在抗腫瘤，抗菌等方面具有廣闊應用前景，適合開發(fā)高效，低毒，無殘留的綠色農藥。有學者研究表明苦豆子水煎液和總生物堿均能明顯抑制金黃色葡萄球菌生物膜的形成，但所分離的總生物堿單體如苦參堿、氧化苦參堿、槐定堿和苦豆堿中均對生物膜形成無抑制作用[11]。本研究的結果也表明低濃度的苦豆子水煎液對乳房鏈球菌生物膜形成能力有明顯抑制作用，但總生物堿單體是否有抑制乳房鏈球菌生物膜作用需要進一步研究。醉馬草是哈薩克醫(yī)生常用的藥材，具有消腫止痛，清熱解毒等功能，并用于腮腺炎和關節(jié)疼痛的治療。有研究發(fā)現(xiàn)醉馬草中的生物總堿能較好的抑制表皮葡萄球菌生物膜形成[10]，被認為醉馬草中含量較高且活性較強的苦馬豆素對菌株生物膜形成的抑制作用較弱(約30%)，說明醉馬草中含有抑制生物膜形成的其它成分，有待進一步揭示。本研究結果顯示低濃度的醉馬草水煎液能抑制乳房鏈球菌生物膜的形成，但是否是其中的苦馬豆素發(fā)揮主要作用尚需深入研究。鹽穗木在新疆主要分布于塔里木盆地。在飼料貧乏的荒漠草場中是一種良好的飼用牧草。前期研究表明鹽穗木具有抑菌活性的物質主要集中在生物堿、有機酸、鞣質和酚性物質之間，且對大腸埃希氏桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌均有抑菌作用[13]，但水提物和浸膏均對鏈球菌無抑菌作用[14]。本實驗結果表明低濃度的鹽穗木水煎液能抑制乳房鏈球菌生物膜的形成，由于生物膜中存在的主要生物大分子是蛋白質、多糖、肽聚糖和磷脂等，而鹽穗木中含有較高的Na+和Cl-，可能鹽穗木水煎液中的這些可溶性鹽分能夠破壞生物膜中的某種成分，從而抑制生物膜的形成，此機制尚不詳，有待進一步實驗驗證。本研究也表明，苦豆子、醉馬草和鹽穗木水煎液在較低的濃度下能較好的抑制乳房鏈球菌生物膜的形成。有報道表明，這些植物被奶牛食用沒有副作用[15-17]，因此可以嘗試將少量的苦豆子、醉馬草和鹽穗木加入患隱性乳房炎的奶牛料草中，從抑菌和抑制生物膜形成的角度來預防和治療奶牛乳房炎。

本實驗結果表明三種植物水煎液均在濃度較大時對乳房鏈球菌生物膜形成抑制作用減弱，甚至有促進作用，導致這一現(xiàn)象的原因可能是植物水煎液中的某些成分濃度較大時會在細菌培養(yǎng)時與形成的生物膜發(fā)生反應，形成沉淀，對OD490的檢測產生干擾。

比較三種植物對乳房鏈球菌生物膜形成影響的結果，醉馬草水煎液的濃度在0. 05%至0. 8%時對生物膜的形成均有較為明顯的抑制作用，且抑制情況較為穩(wěn)定，而苦豆子和鹽穗木水煎液在低濃度時對菌株生物膜的形成情況均表現(xiàn)為不穩(wěn)定，例如苦豆子在濃度為0. 02%和0. 04%時有較高的值，鹽穗木水煎液的OD值比醉馬草的值明顯偏高。因此，三種水煎液中醉馬草對菌株生物膜形成的影響最為明顯。

本實驗所用三種植物均能在低濃度下抑制乳房鏈球菌生物膜的形成，而且三種植物對菌株生長幾乎無影響，說明這三種植物水煎液可以在不影響細菌生長的情況下抑制生物膜形成。因此如何進一步分離純化植物中的活性成分，確定抑制生物膜形成的有效成分，可以為抗生物膜新型藥物的研發(fā)提供實驗依據。

[1]CrowleyRC,LeighJA,WardPN,etal.DifferentialProteinExpressioninStreptococcusuberisunderPlanktonicandBiofilmGrowthConditions[J].ApplEnvironMicrobiol, 2011, 77(1): 382-384.

[2] 黃瑛, 尹曉敏, 李麗好, 等. 奶牛臨床型乳房炎病原菌的分離與鑒定[J]. 中國畜牧獸醫(yī), 2007, 34(12): 74-76.

[3] 王麗君. 南疆地區(qū)奶牛乳房炎性乳房鏈球菌遺傳多樣性分析[D]. 新疆: 塔里木大學, 2011.

[4]LasaqnoMC,ReinosoEB,DieserSA,etal.PhenotypicandgenotypiccharacterizationofStreptococcusuberisisolatedfrombovinesubclinicalmastitisinArgentineandairyfarms[J].RevArgentMicrobiol, 2011, 43(3): 212-217.

[5]WangLJ,ChenW,ZhangLL,etal.GeneticdiversityofStreptococcusuberisisolatesfromdairycowswithsubclinicalmastitisinSouthernXinjiangProvince,China[J].JGenApplMicrobiol, 2013, 59(4): 287-93.

[6]MelchiorMB,VaarkampH,Fink-GremmelsJ.Biofilms:Aroleinrecurrentmastitisinfections[J].VetJ, 2006, 171(3): 398-407.

[7] 干霞芳, 李蒙英. 生物膜和生物膜形成菌的研究[J]. 安徽大學學報, 2007, 31(6): 91-94.

[8]SteeneveldW,SwinkelsJ,HogeveenH.StochasticmodelingtoassesseconomiceffectsoftreatmentofchronicsubclinicalmastitiscausedbyStreptococcusuberis.JDairyRes, 2007, 74(4): 459-467.

[9] 任曉鏷, 陳偉, 張利莉. 不同環(huán)境因素對表皮葡萄球菌生物膜形成的影響[J]. 西北農業(yè)學報, 2011, 20(12): 1-5.

[10] 任曉鏷, 陳偉, 張利莉. 甘草及醉馬草水煎液對表皮葡萄球菌生物膜形成的影響[J]. 中國獸醫(yī)學報, 2013, 33(1): 125-129.

[11] 李延榮. 新疆南疆地區(qū)奶牛乳房炎性金黃色葡萄球菌生物膜形成及其影響因素的研究[D]. 新疆: 塔里木大學, 2013.

[12]BalabanN,CostertonJW.Controlofbiofilminfectionsbysignalmanipulation[M].Berlin:Springer, 2010, 2: 157-170.

[13] 陶大勇, 應璐, 任述強, 等. 塔里木盆地36 種植物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌試驗[J]. 中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志, 2005, 24(5): 23-25.

[14] 賈琦珍, 楊文財, 陶大勇. 鹽穗木活性成分的提取及抑菌效果研究[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī), 2011, 7(上): 88-90.

[15] 張清云, 張國榮, 尹長安, 等. 寧夏苦豆子藥用植物資源保護與開發(fā)利用[J]. 世界科學技術——中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2006, 8(1): 104-108.

[16] 賈納提, 薩赫都拉·霍曼, 努爾蘭. 醉馬草飼喂試驗研究[J]. 新疆畜牧業(yè), 1998, 4: 31.

[17] 賈琦珍, 趙金香, 陶大勇, 等. 卡拉庫爾羊日糧中添加鹽穗木的安全性試驗[J]. 中國草食動物, 2011, 31(6): 38-40.

Effects of Local Plants from the Southern Xinjiang on Biofilm Formation byStreptococcusuberis

Wang Lijun Wang Nan Chen Wei*

(College of Life Science, Tarim University/Key Laboratory of Protection & Utilization of Biological Resources in Tarim Basin, Xinjiang Production & Construction Group, Alar, Xinjiang 843300)

A microtiter assay was used to detect the effects of three special plants from the southern Xinjiang (Sophora alopecuroides, Halostachys caspica and Achnatherum inebrians) on biofilm formation byStreptococcusuberis,inordertoexplorethemethodofpreventionandcureofdairycowmastitis.Theresultsshowedthatalowconcentrationofwaterdecoction(0.05%～1.6%ofSophoraalopecuroides；0.05%～0.8%ofHalostachyscaspica; 0.05%～3.2%ofAchnatheruminebrians)decreasedsignificantlybiofilmformationbyStreptococcusuberiswithoutcellgrowthinhibition.However,highconcentrationofthreeplants(3.2%ofbothSophoraalopecuroidesandHalostachyscaspica; 6.4%ofAchnatheruminebrians)inhibitedcellgrowthweaklybutpromotedsignificantlybiofilmformationbyStreptococcusuberis.

Streptococcusuberis;biofilm;southernXinjiangcharacteristicplants

2014-09-23

塔里木大學校長基金項目(TDZKSS201308)；國家自然科學基金項目(30860018)；教育部新世紀優(yōu)秀人才支持計劃(NCET-11-1071)。

王麗君(1981-)，女，實驗師，碩士，研究方向為病原菌的分子生物學。 E-mail: fenge3721@sina.com

E-mail: chenweialar@sina.com

1009-0568(2015)02-0001-05

S852.61；S853.74

A

10.3969/j.issn.1009-0568.2015.02.001