厲曉杰 楊柳 劉建 羅卓荊

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是困擾絕經(jīng)后婦女健康的一大難題，據(jù)統(tǒng)計，發(fā)展中國家中有約 30% 的絕經(jīng)后婦女患有骨質(zhì)疏松[1-2]。高發(fā)病率、嚴重的并發(fā)癥以及為防治骨質(zhì)疏松而付出的沉重經(jīng)濟支出更加突出了骨質(zhì)疏松研究的緊迫性。

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松是高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松，活躍的骨吸收超過骨形成是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松中骨量丟失的主要原因[3]。雌激素能抑制破骨細胞的分化并通過雌激素 α 受體促進成熟破骨細胞的凋亡[4]。因此，抑制因雌激素突然缺失而導致的破骨細胞活性過度增強成為治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的一種途徑。

Hedgehog 信號通路在骨組織中，能調(diào)節(jié)軟骨細胞的增殖和肥大，能促進間充質(zhì)干細胞 ( BMSC ) 向成骨方向分化[5-6]。在骨轉(zhuǎn)移瘤中，它促進破骨細胞的分化，從而促進骨吸收[7]。而在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松中，Hedgehog 信號對破骨細胞的作用尚未研究清楚。

本研究采用體外模擬骨質(zhì)疏松情況，探究在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的條件下，Hedgehog 信號的改變情況及其對破骨細胞的作用。

材料與方法

一、主要試劑

RAW264.7 細胞購自 ATCC 公司；Murine M-CSF 購自 Peprotech 公司，以 50 ng / ml 濃度使用；RANKL 購自 California bioscience 公司，使用濃度為 100 ng / ml；Purmorphamine 購自 Merck Millipore公司，Vismdegib 購自 Selleck 公司，使用濃度均為1 μm；雌二醇購自 Sigma 公司，使用濃度為 10-8M；無酚紅 α-MEM 培養(yǎng)基購自 Gibico 公司；活性炭處理的胎牛血清 ( FBS ) 購自 Hyclone 公司；TRIzol 購自 Invitrogen 公司；RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自 Takara公司；SYBR green 染料購自 Takara 公司。

二、絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠模型的建立

6 只 8 周大小雌性 C57BL / 6J 小鼠，根據(jù)來源不同隨機數(shù)表法分成兩組：絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型( OVX，Ovariotomized ) 組和假手術(shù)組，每組 3 只。OVX 組，切開背部皮膚，暴露并切除小鼠雙側(cè)卵巢；假手術(shù)組，切開背部皮膚，暴露卵巢，切除附近脂肪組織[8]。切除卵巢后 8 周絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型建立完成，處死后取股骨，取骨髓細胞培養(yǎng)。所有動物實驗操作均通過第四軍醫(yī)大學倫理委員會通過 ( 20110405-5 )。

三、細胞培養(yǎng)及分組

小鼠股骨干來源的骨髓細胞添加于含 10% FBS和 50 ng / ml 的 M-CSF 的無酚紅 α-MEM 培養(yǎng)基中，培養(yǎng)于含 5% CO2、37 ℃ 的恒溫培養(yǎng)箱。培養(yǎng)后3 天，取貼壁細胞繼續(xù)用含有 10% FBS、50 ng / ml的 M-CSF 和 100 ng / ml 的 RANKL 的無酚紅 α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng) 6 天，獲得破骨細胞[9]。提取兩組細胞的總 RNA 并做實時定量 PCR 檢測 Hedgehog 信號通路活性標志基因 Ptch1 和 Gli1 的表達水平 (表1)。

表1 實時定量 PCR 引物序列Fig.1 Real-time PCR primers sequence

RAW264.7 細胞以 1.5×104/ cm2密度接種于細胞培養(yǎng)板并隨機分為 6 組：雌激素組，給予雌二醇以 10-8M 濃度干預；雌激素＋激動劑組，給予10-8M 濃度雌二醇和 1 μm 濃度的 Hedgehog 信號激動劑 Purmorphamine 進行干預；雌激素＋拮抗劑組，給予 10-8M 濃度雌二醇和 1 μm 濃度的 Hedgehog 信號拮抗劑 Vismdegib 進行干預；對照組，不給予任何干預；激動劑組，給予 1 μm 濃度的 Hedgehog 信號激動劑 Purmorphamine 進行干預；拮抗劑組，給予 1 μm 濃度的 Hedgehog 信號拮抗劑 Vismdegib 進行干預。各組細胞用含有 100 ng / ml RANKL 的無酚紅α-MEM 培養(yǎng)基進行培養(yǎng) 5 天，獲得破骨細胞，并進行 RNA 提取和定量 PCR[10]。

RAW264.7 細胞用含有 100 ng / ml RANKL 的無酚紅 α-MEM 培養(yǎng)基進行培養(yǎng) 5 天，以進行 TRAP染色分析。隨機分為 3 組：雌激素組，給予雌二醇以 10-8M 濃度干預；拮抗劑組，給予 1 μm 濃度的 Hedgehog 信號拮抗劑 Vismdegib 進行干預；對照組，不給予任何干預。

四、RNA 提取和定量 PCR

用 TRIzol 提取細胞總 RNA，然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將 RNA 反轉(zhuǎn)錄為單鏈 cDNA。定量 PCR 采用SYBR Green 染料法以 SYBR Green 染料 12.5 μl、雙蒸水 9.5 μl、前后引物各 1 μl、cDNA 樣品 1 μl 配成反應體系。利用 real time PCR 反應儀 ( BIO-RAD 公司 ) 檢測各組樣品中各種基因表達量，并以 GAPDH基因表達量為標準定量。

五、TRAP 染色

培養(yǎng)完成的細胞用 TRAP 試劑盒 ( Sigma ) 進行染色，固定細胞后，蒸餾水沖洗，加入 TRAP 染色液孵育 1 h，蒸餾水沖洗后用蘇木精復染，干燥后觀察。

六、F-actin 染色

細胞培養(yǎng)完成后棄培養(yǎng)基，用 PBS 沖洗后加入 4% 多聚甲醛固定細胞 10 min，PBS 沖洗，0.1%Triton X-100 PBS 溶液處理細胞 10 min，PBS 沖洗，加入鬼筆環(huán)肽 ( Cytoskeleton ) 工作液常溫孵育30 min，PBS 沖洗后加入 DAPI 常溫孵育 5 min，PBS沖洗后甘油封片。

表2 各組細胞中 Ptch1 和 Gli1 的表達 (±s)Fig.2 The expression levels of Ptch1 and Gli1 in different groups of cells (±s)

表2 各組細胞中 Ptch1 和 Gli1 的表達 (±s)Fig.2 The expression levels of Ptch1 and Gli1 in different groups of cells (±s)

基因 基因表達OVX 組 假手術(shù)組Ptch1 0.72400±0.04272 0.44196±0.06822 Gli1 0.66794±0.07331 0.45229±0.05750

表3 各組細胞中 Ptch1 和 Gli1 的表達 (±s)Fig.3 The expression levels of Ptch1 and Gli1 in different groups of cells (±s)

表3 各組細胞中 Ptch1 和 Gli1 的表達 (±s)Fig.3 The expression levels of Ptch1 and Gli1 in different groups of cells (±s)

基因表達雌激素組 對照組 雌激素 + 激動劑組 激動劑組 雌激素 + 拮抗劑組 拮抗劑組Ptch1 0.41317±0.02511 1.00000±0.11771 0.38557±0.06785 0.86403±0.05886 0.30162±0.02208 0.24563±0.02306 Gli1 0.54165±0.03931 0.74160±0.07632 1.00000±0.03138 1.45856±0.05911 0.26856±0.04111 0.32325±0.04611基因

七、統(tǒng)計學處理

所有數(shù)值均采用表示，用 SPSS 16.0t檢驗進行兩兩組間比較，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、OVX 組和假手術(shù)組小鼠成熟破骨細胞中的Ptch1 和 Gli1 表達情況

OVX 組小鼠來源的破骨細胞 Ptch1 和 Gli1 基因表達水平均較假手術(shù)組小鼠來源的破骨細胞高，差異有統(tǒng)計學意義 (P＜0.05 ) ( 表 2，圖 1 )。說明在OVX 組中，Hedgehog 信號活性水平較高。

二、破骨細胞定量 PCR 結(jié)果定量 PCR

與對照組相比，雌激素刺激抑制了破骨細胞中Gli1 和 Ptch1 的表達 (P＜0.05 )。與激動劑組相比，雌激素＋激動劑組中 Gli1 和 Ptch1 表達水平較低(P＜0.01 )。以上結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雌激素在破骨細胞中對Hedgehog 信號有抑制作用 ( 表 3，圖 2 )。

圖1 Ptch1 和 Gli1 在不同組細胞中的表達水平Fig.1 Expression levels of Ptch1 and Gli1 in different cell groups

圖2 Ptch1 和 Gli1 在不同組細胞中的表達水平Fig.2 Expression levels of Ptch1 and Gli1 in different cell groups

三、TRAP 和 F-actin 染色觀察破骨細胞數(shù)目

對照組破骨細胞數(shù)目較雌激素組多，而拮抗劑組破骨細胞數(shù)目較對照組明顯減少，且恢復到雌激素存在情況下的正常生理數(shù)目。F-actin 染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組中具有環(huán)狀細胞骨架的成熟破骨細胞的數(shù)目較雌激素組多，拮抗劑組中破骨細胞數(shù)目較對照組少。這說明，Hedgehog 信號抑制劑能將雌激素缺乏時過多的破骨細胞數(shù)目恢復到雌激素存在時正常水平 (圖 3)。

討 論

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松以其高發(fā)病率、嚴重并發(fā)癥和沉重的社會醫(yī)療費用負擔成為世界健康難題[11]。與其它類型的骨質(zhì)疏松不同的是，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松為高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松。雌激素在骨中能維持成骨和破骨活動的平衡，絕經(jīng)后雌激素水平驟然下降，成骨與破骨平衡打破，破骨細胞介導的骨吸收過度增強成為導致絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的重要因素。因此，破骨細胞成為治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的重要靶點。

Hedgehog 信號通路對于胚胎發(fā)育和多種組織代謝穩(wěn)態(tài)維持都有重要作用[12]。在骨骼系統(tǒng)中，它能促進間充質(zhì)干細胞向成骨方向分化，能調(diào)控軟骨細胞的增殖和肥大，在骨轉(zhuǎn)移瘤的情況下，它還能促進破骨細胞的分化。本研究發(fā)現(xiàn)，Hedgehog 信號的標志性基因 Ptch1 和 Gli1 在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松破骨細胞中表達水平升高。因此，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松破骨細胞中 Hedgehog 信號活性增強。為探究 Hedgehog信號增強是否與雌激素水平降低有關(guān)，筆者使用RAW264.7 細胞體外模擬絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松條件，即人為去除或加入雌激素模擬絕經(jīng)后條件和正常條件。Purmorphamine 和 Vismdegib 分別是 Hedgehog 信號的激動劑和拮抗劑，作用與 Hedgehog 信號的 SMO受體，分別激動和抑制下游轉(zhuǎn)錄因子的活化。

本研究結(jié)果顯示，與雌激素存在時相比，去除雌激素時 Hedgehog 信號活性較高，而且雌激素能減弱 Hedgehog 激動劑對 Ptch1 和 Gli1 表達的促進作用，因此雌激素在破骨細胞中能抑制 Hedgehog信號。以上結(jié)果表明，破骨細胞中，雌激素對Hedgehog 信號有抑制作用。這可能是由于正常生理狀態(tài)下，雌激素維持在正常水平，而正常水平的雌激素對 Hedgehog 信號有一定的抑制作用，進而抑制了破骨細胞的分化成熟。絕經(jīng)后，雌激素水平驟然下降，雌激素對 Hedgehog 信號的抑制被解除，Hedgehog 活化，進而促進破骨細胞的形成，促進骨吸收，引起骨量下降。當采用 Vismdegib 處理雌激素缺乏情況下的破骨細胞后發(fā)現(xiàn)，原過度激活的破骨細胞在 Vismdegib 的作用下被抑制，恢復到雌激素正常情況下的水平。

圖3 破骨細胞數(shù)目比較 a：不同組細胞 TRAP 染色結(jié)果；b：不同細胞 F-actin 染色Fig.3 Osteoclasts number in different groups a: TRAP staining; b: F-actin staining

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松小鼠破骨細胞中 Hedgehog 信號活性較高；破骨細胞中雌激素可抑制 Hedgehog 信號的活性，使破骨細胞活性恢復至正常情況，從而減少骨吸收，改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松中破骨細胞數(shù)目過多的狀況；同時，Hedgehog 信號通路抑制劑也具有相同的作用。因此，抑制 Hedgehog 信號通路可以作為治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的新靶點。

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