鄭亞琴，邱艷麗，汪 偶，臧 鑫，李 倩

（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥物分析教研室，黑龍江哈爾濱150000）

氣相色譜法測(cè)定自釀葡萄酒中甲醇的含量

鄭亞琴，邱艷麗，汪 偶，臧 鑫，李 倩*

（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥物分析教研室，黑龍江哈爾濱150000）

目的：針對(duì)人們所擔(dān)憂的葡萄酒中甲醇含量超標(biāo)的問題，本實(shí)驗(yàn)建立一種測(cè)定自釀葡萄酒中的甲醇含量的方法。方法：采用氣相色譜法對(duì)葡萄酒中的雜質(zhì)甲醇進(jìn)行定量檢測(cè)。色譜條件：固定相為GsBP-InoWAX毛細(xì)管柱，柱溫為90℃，載氣為氮?dú)?，流速?.4 mL/min；以氫焰離子化檢測(cè)器（FID）為檢測(cè)器，溫度為200℃；進(jìn)樣口溫度為150℃。結(jié)果：該方法在16～1000 μg/mL的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2=0.9987），精密度為1.2%，回收率為90.03%～94.00%。結(jié)論：該方法快速準(zhǔn)確，分析成本低，能夠滿足快速分析自釀葡萄酒中甲醇的要求。

氣相色譜，甲醇，自釀葡萄酒

葡萄酒具有美容養(yǎng)顏、延年益壽、預(yù)防疾病的功能[1]，而自釀葡萄酒不僅保留葡萄酒的風(fēng)味還經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，所以自釀葡萄酒在老百姓的生活中普遍存在。有傳言稱自釀葡萄酒中甲醇含量易超標(biāo)，經(jīng)常飲用會(huì)對(duì)身體產(chǎn)生有害作用。甲醇為無色有酒精氣味易揮發(fā)的液體，易溶于水、醇類、乙醚等。以各類糧食釀造的酒，其中甲醇含量較低；而薯干、谷糠、野生植物等為原料時(shí)，酒中的甲醇含量則較高[2]，甚至有報(bào)道自釀葡萄酒甲醇易超標(biāo)中毒。甲醇在體內(nèi)代謝成甲醛和甲酸，對(duì)視神經(jīng)毒性最大，飲用含有過量甲醇的酒可致失明、肝病、甚至死亡[3]。因此檢測(cè)自釀葡萄酒中甲醇的含量，對(duì)保證人體健康具有重要意義。為此，本文擬建立一種分析測(cè)定方法，旨在測(cè)定自釀葡萄酒中甲醇含量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

正丙醇 分析純、天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；無水乙醇 分析純、天津市永大化學(xué)試劑有限公司；甲醇 分析純、天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；市售酒樣 購自哈爾濱家得樂連鎖超市；葡萄 品種為夏黑、購自哈爾濱家得樂連鎖超市；酵母 安琪牌；水去離子水。

Thermo Trace 1300氣相色譜儀（GC） Thermo Trace；Agilent 6820氣相色譜儀（GC） 美國(guó)安捷倫；電子天平 分度值0.1 mg，Mettler-Toledo。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紅葡萄酒的釀造 葡萄經(jīng)清洗破碎添加酵母，敞口浸漬發(fā)酵9 d，分離皮渣，將皮渣壓榨，將壓榨汁勾兌入分離時(shí)的自流汁中，密封二次發(fā)酵（20 d），然后靜置澄清（4 d），分離上清液，澄清葡萄酒放入橡木桶，桶中陳釀（30 d）最后制成紅酒[4]。

1.2.2 色譜條件 柱溫為90℃；以氮?dú)鉃檩d氣，柱流速為1.4 mL/min，進(jìn)樣口溫度為150℃；火焰離子化檢測(cè)器（FID）檢測(cè)，溫度為200℃，GsBP-InoWAX毛細(xì)管柱；分流比為20∶1；進(jìn)樣量為0.2 μL。

1.2.3 溶液的制備

1.2.3.1 內(nèi)標(biāo)溶液的配制 精密稱取0.9991 g正丙醇于100 mL容量瓶中，用去離子水溶解并稀釋至刻度，作為內(nèi)標(biāo)溶液。

1.2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取1.0018 g甲醇于50 mL容量瓶中，用去離子水溶解并稀釋到刻度，作為甲醇標(biāo)準(zhǔn)溶液。

分別量取20.00 mg/mL甲醇溶液0、1、2、3、4、5 mL，量取6份5.0 mL的10.00 mg/mL正丙醇溶液（內(nèi)標(biāo)物）分別加到甲醇溶液中，用去離子水稀釋，制成內(nèi)標(biāo)濃度為0.50 mg/mL，甲醇濃度為0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mg/mL的待測(cè)系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

精密稱取0.9988 g乙醇于50 mL容量瓶中，用去離子水溶解并稀釋到刻度，作為乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3.3 供試品溶液的配制 分別量取自釀葡萄酒1.00 mL，正丙醇溶液0.5 mL于10 mL容量瓶中，用去離子水稀釋至刻度得到自釀樣品溶液。分別量取市售葡萄酒5.0 mL，正丙醇溶液0.5 mL于10 mL容量瓶中，用去離子水稀釋至刻度，得到市售樣品溶液。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理方法為SPSS 13.0軟件的T檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性范圍考察

按照“1.2.2”設(shè)定的參考條件，將待測(cè)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液分別進(jìn)樣0.2 μL，直接測(cè)定，以峰面積比值（x）對(duì)甲醇濃度（y）做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖1所示，甲醇濃度在16～1000 μg/mL的濃度范圍內(nèi)線性方程為y=0.8651x＋0.0135，R2為0.9987，表明該方法的線性良好。

圖1 甲醇標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of methanol

2.2 專屬性

將甲醇、正丙醇和乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液混合振搖均勻后，按1.2.2方法進(jìn)樣0.2 μL，直接測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果見圖2。甲醇的保留時(shí)間為2.223 min；乙醇為2.282 min；正丙醇為2.558 min，基線平穩(wěn)，三者分離良好。

圖2 專屬性考察色譜分析圖Fig.2 The chromatogram of specificity

2.3 精密度

結(jié)果見表1。將甲醇濃度為0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，得到甲醇含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.2%。

表1 精密度實(shí)驗(yàn)Table 1 Precision test

2.4 回收率

在已知濃度的樣品溶液中加入已知量的甲醇標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定其加標(biāo)回收率。根據(jù)線性曲線，選擇0.50 mg/mL為中心濃度，按其80%、100%、120%的比例分別配制9份溶液（每種濃度各3份），分別與樣品溶液等體積混合，按照氣相條件進(jìn)樣0.2 μL，記錄色譜圖，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。根據(jù)表2結(jié)果可知回收率在90.03%～94.00%范圍內(nèi)，表明準(zhǔn)確度良好，符合雜質(zhì)定量檢測(cè)的要求。

表2 回收率實(shí)驗(yàn)Table 2 Recovery test

2.5 檢測(cè)限

當(dāng)信噪比（S/N）為3時(shí)，測(cè)得甲醇含量為0.004 mg/mL，故檢測(cè)限為0.004 mg/mL。

2.6 定量限

當(dāng)信噪比（S/N）為10時(shí)，測(cè)得甲醇含量為0.016 mg/mL，故定量限為0.016 mg/mL。

2.7 樣品測(cè)定

將配制好的樣品按“1.2.1”設(shè)定的參考條件分別進(jìn)樣0.2 μL，得到樣品色譜圖，見圖3；自釀樣品溶液和市售樣品溶液分別連續(xù)進(jìn)樣5針，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中甲醇的含量，最后取平均值，見表3。由結(jié)果可知，市售葡萄酒樣品中甲醇含量符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（＜0.4 mg/mL[5]），而自釀葡萄酒中甲醇含量普遍高于市售葡萄酒，個(gè)別甲醇含量嚴(yán)重超出國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)范圍。

圖3 葡萄酒樣品色譜圖Fig.3 The chromatogram of wine

表3 葡萄酒中甲醇含量測(cè)定結(jié)果Table 3 Methanol in wine

3 結(jié)論與討論

本文以正丙醇為內(nèi)標(biāo)，采用GC/FID法測(cè)定自釀葡萄酒中甲醇的含量。外標(biāo)法是現(xiàn)在測(cè)定酒中甲醇、雜醇油的標(biāo)準(zhǔn)方法[6]，與外標(biāo)法相比，內(nèi)標(biāo)法具有重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高，可在一定程度上消除操作條件等的變化所引起的誤差[7-10]。正丙醇作為內(nèi)標(biāo)物，其結(jié)構(gòu)與甲醇相似，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不與甲醇發(fā)生反應(yīng)，與甲醇的分離度大于1.5，是理想的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。有文獻(xiàn)報(bào)道采用頂空進(jìn)樣效果較好[11-12]，但其設(shè)備要求苛刻，價(jià)格昂貴，影響因素較多；另有文獻(xiàn)報(bào)道可采用填充柱GC法，因酒中成分復(fù)雜，高沸點(diǎn)的成分流不出柱子易污染氣化室和色譜柱[13]，所以不適合酒樣的檢測(cè)。本方法采用直接進(jìn)樣，成本低，操作簡(jiǎn)便，用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，適合于酒樣的測(cè)定。同時(shí)可以滿足快速、準(zhǔn)確地分析葡萄酒中甲醇含量的需求。

在本次測(cè)定的過程中，發(fā)現(xiàn)不同的制備過程中葡萄酒的甲醇含量也不同。為此推斷因葡萄的產(chǎn)地，葡萄的選擇、盛裝器皿、儲(chǔ)存時(shí)間不同以及制備方法的不同都會(huì)影響自釀葡萄酒中甲醇的含量。自釀葡萄酒雖經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，但在生產(chǎn)流程中存在難以人為控制的因素，而造成其甲醇含量難以控制，進(jìn)而帶來相應(yīng)危害。綜上所述，從健康角度出發(fā)，應(yīng)慎重制造和飲用自釀葡萄酒。

根據(jù)以上的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，各組分分離度均大于1.5，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%，小于10%，加標(biāo)回收率在90.03%～94.00%之間，且定量限小于甲醇的國(guó)標(biāo)（400 mg/mL），該方法符合葡萄酒、果酒通用分析方法（GB/T15038-2006），同時(shí)也滿足氣相色譜方法驗(yàn)證的各項(xiàng)要求。本文建立了一種快速簡(jiǎn)便的檢測(cè)酒中甲醇含量的氣相色譜法，即以正丙醇為內(nèi)標(biāo)，采用GC/FID和GsBP-InoWAX毛細(xì)管柱，對(duì)樣品直接進(jìn)樣進(jìn)行分析。該方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，樣品不需要任何處理，而且進(jìn)樣量小，分析周期短，3 min即可，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，樣品對(duì)毛細(xì)管色譜柱基本無污染，準(zhǔn)確度高，靈敏性好，適合成分復(fù)雜的樣品的檢測(cè)，是一種高效、低成本、簡(jiǎn)捷的檢測(cè)葡萄酒中甲醇含量的方法。

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Determination of methanol in self-made wine by gas chromatography

ZHENG Ya-qin，QIU Yan-li，WANG Ou，ZANG Xin，LI Qian*
（Department of Pharmaceutical Analysis of Harbin Medical University，Harbin 150000，China）

Objective：The aim of this investigation was to develop a method to detect methanol quantitatively in self-made wine.Methods：Using gas chromatography for quantitative detection of methanol in wine.The chromatographic conditions：stationary phase was capillary column of GsBP-InoWAX，column temperature：90℃，carrier gas：nitrogen，flow rate：1.4 mL/min；hydrogen flame ionization detector（FID）as the detector，the temperature was 200℃；the inlet temperature was 150℃.Results：The data showed that in the concentration range of 16～1000 μg/mL，a good linear relationship（R2=0.9987）.The method was validated with a good accuracy and the relative standard deviation（RSD）was 1.2%.Recovery was between 90.03%～94.00%. Conclusion：Quick and relatively low-cost method was developed，and the method was appropriate for quantitative analysis of methanol in self-made wine.

gas chromatography；methanol；self-made wine

TS261.7

A

1002-0306（2015）22-0054-03

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.002

2015－01－30

鄭亞琴（1992-），女，碩士研究生，研究方向：藥物分析，E-mail：13054288759@163.com。

*通訊作者：李倩（1976-），女，博士，副教授，研究方向：體內(nèi)藥物分析及藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定，E-mail：liqian@ems.hrbmu.edu.cn。

國(guó)家自然科學(xué)基金（31100835）；中國(guó)博士后面上基金資助（2013M531066）；黑龍江省博士后資助LBH-Z11059。