王順，高瑞昶（天津大學(xué)化工學(xué)院，天津300072）

產(chǎn)α-淀粉酶抑制劑的藥用植物內(nèi)生放線菌的篩選

王順，高瑞昶
（天津大學(xué)化工學(xué)院，天津300072）

第一作者：王順（1991—），男，碩士研究生。聯(lián)系人：高瑞昶，副教授。E-mail pharmacy@tju.edu.cn。

摘要：α-淀粉酶抑制劑屬于糖苷水解酶抑制劑中的一種，能有效地抑制腸道內(nèi)唾液及胰淀粉酶的活性，阻礙食物中碳水化合物的水解和消化，減少糖分的攝取，降低血糖和血脂含量水平，使食后不產(chǎn)生高血糖癥。本實(shí)驗(yàn)利用快速靈敏的比色法，對(duì)從幾種藥用植物體內(nèi)分離得到的70株內(nèi)生放線菌菌絲提取物和發(fā)酵液的α-淀粉酶抑制活性進(jìn)行了檢測，得出：具有產(chǎn)胞外α-淀粉酶抑制劑活性的菌株19株，抑制率達(dá)70%以上的有6株；產(chǎn)胞內(nèi)α-淀粉酶抑制劑活性的菌株16株，其中抑制率達(dá)70%以上的有3株；既能產(chǎn)胞內(nèi)α-淀粉酶抑制劑又能產(chǎn)胞外α-淀粉酶抑制劑的菌株7株。從菌株WS19發(fā)酵液中分離獲得了α-淀粉酶抑制劑WSI19，對(duì)α-淀粉酶和α-麥芽糖酶均有顯著抑制，且對(duì)麥芽糖酶的抑制性比同劑量的奧恬蘋還強(qiáng)11.2倍。經(jīng)小鼠糖耐量實(shí)驗(yàn)，證實(shí)WSI19對(duì)餐后高血糖有明顯改善?？傮w上看，藥用植物內(nèi)生放線菌具有很大的產(chǎn)α-淀粉酶抑制劑潛力，可進(jìn)一步為開發(fā)糖尿病藥物。

關(guān)鍵詞：α-淀粉酶抑制劑；內(nèi)生放線菌；活性；篩選

放線菌是酶、酶抑制劑、抗生素等生物活性物質(zhì)的主要生產(chǎn)菌。據(jù)統(tǒng)計(jì)，微生物產(chǎn)生的2萬多種生物活性物質(zhì)中，45%以上是由放線菌產(chǎn)生的[1]。其中，藥用植物內(nèi)生放線菌是一類開發(fā)相對(duì)較少的新型微生物資源，目前該類微生物已在植被保護(hù)、農(nóng)林業(yè)生物防治、醫(yī)藥開發(fā)等方面顯現(xiàn)出了廣泛的應(yīng)用前景。α-淀粉酶抑制劑是一種糖苷水解酶抑制劑，能有效地抑制唾液α-淀粉酶和胰α-淀粉酶的活性，阻礙食物中碳水化合物的水解和消化，減少葡萄糖的產(chǎn)生和攝取，降低血糖和血脂水平[2]。在臨床上，α-淀粉酶抑制劑可有效預(yù)防與治療糖尿病和高血脂癥，既可以單獨(dú)使用，也可以與其他降糖藥或降血脂藥聯(lián)合使用；農(nóng)業(yè)上，α-淀粉酶抑制劑基因可作為抗蟲基因，改良植物抗蟲性，從而減少殺蟲劑的使用；在酶學(xué)研究方面，可作為探究淀粉酶活性部位的分析工具，作為測定淀粉酶同工酶的反應(yīng)物等[3]。因此，α-淀粉酶抑制劑的應(yīng)用前景十分廣闊。

1　實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1生產(chǎn)菌株和模式生物

70株藥用植物內(nèi)生放線菌（由本實(shí)驗(yàn)室保存），32只健康小鼠（實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部飼養(yǎng)）。

1.2培養(yǎng)基

1.2.1活化培養(yǎng)基

（1）ISP2固體培養(yǎng)基酵母提取物4g/L，麥芽混合物10g/L，葡萄糖4g/L，瓊脂1.5%，pH值7.3。用于菌體初步活化。

（2）貝奈特培養(yǎng)基酵母提取物1g/L，牛肉浸膏1g/L，酶解酪素4g/L，葡萄糖10g/L，瓊脂2%，pH值7.0。用于菌體進(jìn)一步活化。

1.2.2種子培養(yǎng)基

可溶性淀粉5g/L，葡萄糖5g/L，牛肉浸膏1g/L，蛋白胨1g/L，酵母粉1g/L，自然pH值。

1.2.3發(fā)酵培養(yǎng)基

葡萄糖20g/L，可溶性淀粉10g/L，黃豆粉25g/L，酵母粉4g/L，牛肉浸膏1g/L，氯化鈉2g/L，磷酸氫二鉀0.05g/L，pH值為7.0～7.2。

以上培養(yǎng)基滅菌條件均為115℃、30min。

1.3試劑

（1）拜糖蘋（阿卡波糖）[4]、奧恬蘋（米格列醇）[5]、α-淀粉酶、α-麥芽糖酶、葡萄糖體外診斷試劑盒，均購買自北京中生生物工程公司。

（2）DNS溶液6.3g 3,5-二硝基水楊酸+ 500mL 2mol/L NaOH+182.0g酒石酸鉀鈉+5.0g苯酚+5.0g NaS2O5+H2O至1000mL，放置10天后便可使用，棕色瓶保存。

（3）α-淀粉酶、α-麥芽糖酶溶液各取α-麥芽糖酶、α-淀粉酶100g溶于100mL磷酸鹽緩沖液中，稀釋成系列溶度。

1.4培養(yǎng)方法[6]

（1）菌種活化將保存在?80℃的70株藥用植物內(nèi)生放線菌接種至ISP2固體平板培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)至長出成熟單菌落，轉(zhuǎn)至貝奈特斜面培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)至長出成熟單菌落。

（2）種子培養(yǎng)斜面培養(yǎng)基單菌落轉(zhuǎn)至50mL發(fā)酵管中，裝液量10mL，28℃、180r/min培養(yǎng)48h。

（3）發(fā)酵培養(yǎng)50mL發(fā)酵管裝液量10mL，接種量10%（體積分?jǐn)?shù)），28℃、180r/min培養(yǎng)96h。

1.5制備發(fā)酵液和菌絲提取物溶液

將菌體發(fā)酵物從發(fā)酵管轉(zhuǎn)至40mL離心管中，9000r/min離心15min，收集菌體和發(fā)酵液。將菌體配置成一定濃度的菌懸液，超聲破碎菌體。具體條件是[7]：①取96h培養(yǎng)液于5000r/min下離心5min收集菌體；②用pH值為7.5的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液洗滌3次，再用該緩沖液將菌體配成1∶3的菌懸液，置于40mL大塑料試管內(nèi)；③置于冰浴中超聲波破碎（功率200 W，1/2探頭，破碎30s，間歇30s）；④破碎液于12000r/min下高速冷凍離心30min，收集上清夜。制得的發(fā)酵液與菌絲提取物溶液均保存在?80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6分析方法

1.6.1產(chǎn)α-淀粉酶抑制劑菌株的初步篩選

根據(jù)酶與底物在催化過程中的特點(diǎn)來建立篩選模型。由于與淀粉酶反應(yīng)的底物是淀粉，淀粉經(jīng)酶解后轉(zhuǎn)變?yōu)閱翁?，失去了能與I2結(jié)合呈特有的藍(lán)色的顯色反應(yīng)。一般采用淀粉水瓊脂平板和淀粉溶液篩選兩個(gè)篩選模型，前者是觀察水解圈的大小，后者是觀察最終顏色變化。

α-淀粉酶抑制劑淀粉溶液篩選模型的建立[8]：取0.5mL一定濃度的α-淀粉酶溶液，加入0.5mL待測液，37℃作用10min后，加入2mL一定濃度的淀粉，37℃反應(yīng)一定時(shí)間后，加入碘液，如有藍(lán)色出現(xiàn)說明有α-淀粉酶抑制活性物存在。根據(jù)溶液遇碘不變藍(lán)所需時(shí)間的長短即可判斷待測液中有無α-淀粉酶抑制活性物及活性的高低。本步驟及以下實(shí)驗(yàn)均做3個(gè)重復(fù)。

1.6.2α-淀粉酶抑制劑活性的測定方法

將初篩得到的具有α-淀粉酶抑制活性的發(fā)酵液和菌絲提取物溶液經(jīng)9000r/min低溫離心15min，收集上清液，用截留相對(duì)分子質(zhì)量為6000D和1000D的膜濾過后，收集具有α-淀粉酶抑制活性的餾分，經(jīng)180D納濾膜濃縮[9]；再用001×7型強(qiáng)陽離子交換樹脂柱吸附α-淀粉酶抑制劑[10]，用1mol/L氨水為洗脫液洗脫，收集具有α-淀粉酶抑制活性的餾分，洗脫液經(jīng)減壓旋蒸去除氨水，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用3,5-二硝基水楊酸（DNS）比色法測還原性糖含量，以確定其抑制率[11]。

（1）實(shí)驗(yàn)測定組取合適濃度的α-淀粉酶0.25mL，加入樣品液0.25mL，37℃孵化10min后，加入合適濃度的可溶性淀粉0.5mL，37℃準(zhǔn)確反應(yīng)5min后，加入1mL DNS試劑，沸水浴10min，迅速冷卻至室溫，稀釋至適當(dāng)?shù)谋稊?shù)測定其在520nm的吸光值。

（2）對(duì)照組共設(shè)計(jì)4個(gè)對(duì)照組，包括陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組、空白對(duì)照組和純酶組。以排除待測樣品、酶等本底物的影響，并與市售抑制劑拜糖蘋（陽性對(duì)照）作出比較。其中陰性對(duì)照組將α-淀粉酶改為空白培養(yǎng)基，其余不變；陽性對(duì)照組將待測液改為等量10?4mol/L拜糖蘋，其余不變；空白對(duì)照組將酶和待測液均改為等量水，其余不變；純酶對(duì)照組將待測液改為等量水，其余不變。

待測樣品α-淀粉酶抑制劑的抑制率由式（1）～式（3）計(jì)算。

式中，AE為純酶組（不加抑制劑）測得的吸光值，At1為實(shí)驗(yàn)測定組測得的吸光值；At2為陰性對(duì)照組測得的吸光值；At0陽性對(duì)照組側(cè)得的吸光值。

1.6.3α-淀粉酶抑制劑抑制效果分析

活性測定后，選具有最高α-淀粉酶抑制活性的菌株WS19進(jìn)行進(jìn)一步的抑制效果分析。菌株發(fā)酵液經(jīng)超濾、納濾、陽離子樹脂吸附、減壓旋蒸和真空干燥等流程后，得到具有α-淀粉酶抑制活性的物質(zhì)WSI19，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。

（1）對(duì)α-淀粉酶抑制效果的測定取0.0125mg/mL的α-淀粉酶0.25mL，加入0.25mL系列稀釋的α-淀粉酶抑制劑溶液，37℃孵化10min后，加入0.5mL 3.75mg/mL可溶性淀粉，37℃準(zhǔn)確反應(yīng)5min后，加入1mL DNS試劑，沸水浴10min，迅速冷卻至室溫，測定在520nm的吸光值。繪制相對(duì)酶活力隨抑制劑濃度變化的劑量依賴抑制曲線。

（2）對(duì)α-麥芽糖酶抑制效果的測定取0.1%麥芽糖0.5mL，加入0.25mL系列稀釋的α-淀粉酶抑制劑溶液，后加入0.25mL α-麥芽糖酶啟動(dòng)反應(yīng)，37℃孵化30min后沸水浴5min，迅速冷卻至室溫，用葡萄糖氧化酶法測定490nm光吸收值（以葡萄糖體外診斷試劑盒說明書為指導(dǎo)）[12]。繪制相對(duì)酶活力隨抑制劑濃度變化的劑量依賴抑制曲線。

1.6.4α-淀粉酶抑制劑對(duì)小鼠餐后血糖升高的抑制

選取體重相當(dāng)?shù)慕】敌∈?2只，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、拜唐蘋組、奧恬蘋組和WSI19組，每組各8只。實(shí)驗(yàn)前12h開始禁食，取相同劑量的拜唐蘋、奧恬蘋和WSI19與淀粉混合（3g/kg）后，分別對(duì)小鼠給藥，在給藥后0min、30min、60min、120min進(jìn)行靜脈采血，用葡萄糖體外診斷試劑盒測定小鼠血糖水平。

2　結(jié)果與討論

2.1產(chǎn)α-淀粉酶抑制劑菌株的初步篩選結(jié)果

2.1.1初篩的模型確定

（1）α-淀粉酶濃度的確定向體系中加入足夠的淀粉，以控制所用α-淀粉酶的濃度。為使酶保持活性，反應(yīng)時(shí)間控制在20min以內(nèi)，設(shè)定反應(yīng)時(shí)間為15min，淀粉濃度為5mg/mL。

采用淀粉溶液篩選模型，空白對(duì)照組體系如表1所示。

取0.5mL濃度分別為0.005mg/mL、0.01mg/mL、

0.025mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.25mg/mL 的α-淀粉酶，加入0.5mL水，在37℃下作用10min后，加入2mL濃度為5mg/mL的淀粉，37℃分別反應(yīng)15min后，加入碘液，如有藍(lán)色出現(xiàn)說明淀粉仍未反應(yīng)完，無藍(lán)色出現(xiàn)說明淀粉已經(jīng)反應(yīng)完。結(jié)果如表2所示。

具體顏色顯示，如圖1所示。

結(jié)果顯示，在不加抑制劑的情況下，反應(yīng)15min后，要使淀粉反應(yīng)完全，應(yīng)選α-淀粉酶濃度為0.05mg/mL。

表1　空白對(duì)照體系（3mL）

圖1　不同濃度α-淀粉酶的反應(yīng)結(jié)果

表2　不同淀粉酶濃度的反應(yīng)結(jié)果

（2）拜糖蘋濃度的確定陰性對(duì)照組篩選體系不變，將α-淀粉酶改為等量空白培養(yǎng)基，其余不變。加入淀粉后，37℃分別反應(yīng)12min、13min、14min、15min、16min，觀察顏色變化，結(jié)果如表3所示。

表3　不同反應(yīng)時(shí)間的反應(yīng)結(jié)果

結(jié)果顯示，在加空白培養(yǎng)基的條件下，淀粉反應(yīng)完全的時(shí)間幾乎不變，即空白培養(yǎng)基幾乎不存在α-淀粉酶抑制活性。

陽性對(duì)照組篩選體系不變，將待測液改為等量合適濃度拜糖蘋，其余不變。拜糖蘋濃度分別為10?2mol/L、10?3mol/L、10?4mol/L、10?5mol/L、10?6mol/L，觀察顏色變化。結(jié)果如表4所示。

表4　不同拜糖蘋濃度的反應(yīng)結(jié)果

結(jié)果顯示，拜糖蘋濃度為10?4mol/L時(shí)，可作為陽性對(duì)照。

最終確定的篩選體系如表5所示。

表5　最終確定的篩選體系（3mL）

2.1.2發(fā)酵液具有α-淀粉酶抑制活性的菌株篩選

采用上述篩選體系，篩選到發(fā)酵液中具有α-淀粉酶抑制活性且抑制率接近10?4mol/L拜糖蘋的菌株及最終顏色如表6所示。

表6　發(fā)酵液篩選結(jié)果

結(jié)果顯示，共篩選到發(fā)酵液具有α-淀粉酶抑制活性的菌株19株。部分顏色顯示可參見圖2。

2.1.3菌絲提取物溶液具有α-淀粉酶抑制活性的菌株篩選

篩選到具有抑制活性且抑制率達(dá)到10?4mol/L拜糖蘋的抑制率的菌株及最終顏色如表7所示。

結(jié)果顯示，共篩選到菌絲提取物溶液具有α-淀粉酶抑制活性的菌株16株。部分顏色顯示可參見圖3。

發(fā)酵液和菌絲提取物都具有α-淀粉酶抑制活性的菌株有7株，如表8所示。

圖2　部分菌株發(fā)酵液測得的顏色顯示結(jié)果

表7　菌絲提取物篩選結(jié)果

圖3　部分菌株菌絲提取物溶液測得的顏色顯示結(jié)果

2.2α-淀粉酶抑制劑活性的測定結(jié)果

取合適濃度的α-淀粉酶0.25mL，加入樣品液0.25mL，37℃孵化10min后，加入合適濃度的可溶性淀粉0.5mL，37℃準(zhǔn)確反應(yīng)5min后，加入1mL DNS試劑，沸水浴10min，迅速冷卻至室溫，稀釋至適當(dāng)?shù)谋稊?shù)測定其在520nm的吸光值A(chǔ)。

表8　反應(yīng)結(jié)果

圖4　不同濃度淀粉對(duì)應(yīng)系統(tǒng)本底的A值

（1）不同濃度淀粉對(duì)系統(tǒng)本底A值的影響1mL反應(yīng)體系中，加入終濃度為15mg/mL、7.5mg/mL、3.75mg/mL、1.875mg/mL、0.9375mg/mL可溶性淀粉，結(jié)果表明，不同濃度淀粉對(duì)反應(yīng)系統(tǒng)的本底A值影響很小，均在0.001～0.003范圍內(nèi)。反應(yīng)結(jié)果如圖4所示。

（2）不同濃度α-淀粉酶對(duì)系統(tǒng)本底A值的影響1mL反應(yīng)體系中，加入終濃度為0.05mg/mL、0.025mg/mL、0.0125mg/mL、0.00625mg/mL、0.003125mg/mL α-淀粉酶，結(jié)果表明，不同濃度α-淀粉酶對(duì)反應(yīng)系統(tǒng)的本底A值相對(duì)影響較大，并隨濃度升高而增大（如圖5所示）。考慮α-淀粉酶對(duì)系統(tǒng)本底影響及系統(tǒng)所需要酶的含量，最終確定反應(yīng)系統(tǒng)中α-淀粉酶終濃度為0.0125mg/mL。

（3）體系中α-淀粉酶與淀粉比例的確定[18]確定1mL反應(yīng)體系中α-淀粉酶終濃度為0.0125mg/mL后，考察不同終濃度（15mg/mL、7.5mg/mL、3.75mg/mL、1.875mg/mL、0.9375mg/mL）可溶性淀粉對(duì)酶活性測定中A值范圍的影響，結(jié)果如圖6所示。

鑒于1mL體系中15mg/mL、7.5mg/mL、3.75mg/mL、1.875mg/mL、0.9375mg/mL淀粉對(duì)系統(tǒng)本底影響很小，在無α-淀粉酶抑制劑存在時(shí)，系統(tǒng)反應(yīng)后A值在0.6～1.4范圍內(nèi)有利于抑制劑活性強(qiáng)弱的比較。因此，最終選擇1mL反應(yīng)系統(tǒng)中可溶性淀粉終濃度為3.75mg/mL。最終確定的反應(yīng)體系如表9所示。

（4）吸光度A值的測定及抑制率計(jì)算應(yīng)用上述體系，對(duì)初篩得到的菌株發(fā)酵液和菌絲提取物溶液分別測定A值，并計(jì)算其抑制率。

分別測定純酶組A值，陽性對(duì)照組A值，發(fā)酵液的實(shí)驗(yàn)測定組A值和陰性對(duì)照組A值，并計(jì)算抑制率，如表10、表11所示。

發(fā)酵液和菌絲提取物溶液都具有α-淀粉酶抑制活性的7株菌的抑制率比較如圖7所示。

表10、表11和圖7顯示，抑制率測定結(jié)果和初篩結(jié)果基本相同，發(fā)酵液抑制率相對(duì)較強(qiáng)的菌株有9株，其中抑制率達(dá)70 %以上的有6株，分別為WS-9、WS-19、WS-27、WSX-4、WD-3、WD-29。菌絲提取物溶液抑制率相對(duì)較強(qiáng)的有6株，其中抑制率達(dá)70 %以上的有3株，分別為WS-27、WD-33、WSS-2。且發(fā)酵液和菌絲提取物都具有抑制活性的7株菌中，發(fā)酵液的抑制活性均略高于菌絲提取物溶液的活性。

圖5　不同濃度α-淀粉酶對(duì)應(yīng)系統(tǒng)本底的A值

圖6　體系中加入不同淀粉對(duì)應(yīng)的不同A值

表9　最終確定的反應(yīng)體系（1mL）

圖7　7株菌的抑制率比較

圖8　WSI19和拜糖蘋對(duì)α-淀粉酶的劑量依賴抑制曲線

2.3菌株WS19發(fā)酵液中的α-淀粉酶抑制劑的抑制活性

經(jīng)測定，70株菌株中，菌株WS19的發(fā)酵液具有最高的α-淀粉酶抑制劑活性，為88.0%，故對(duì)其發(fā)酵液進(jìn)行了進(jìn)一步處理，得到了具備α-淀粉酶抑制劑活性的白色粉末狀物質(zhì)150mg，命名為WSI19，并進(jìn)行了進(jìn)一步分析。

將WSI19與市售的α-淀粉酶抑制劑拜糖蘋進(jìn)行比較后，以抑制劑濃度為橫坐標(biāo)，α-淀粉酶的相對(duì)活力為縱坐標(biāo)繪制劑量依賴的抑制曲線（圖8）。結(jié)果顯示，WSI19對(duì)α-淀粉酶具有一定的抑制作用，其半數(shù)抑制濃度（IC50）值為拜糖蘋的25.5倍，即WSI19對(duì)α-淀粉酶的抑制活性較拜糖蘋弱25.5倍。為了進(jìn)一步確定該抑制劑是否具有其他α-糖苷酶抑

表10　發(fā)酵液對(duì)應(yīng)A值及抑制率

表11　菌絲提取物溶液對(duì)應(yīng)A值及抑制率

進(jìn)行了比較，以抑制劑濃度為橫坐標(biāo)，α-麥芽糖酶的相對(duì)活力為縱坐標(biāo)繪制劑量依賴的抑制曲線（圖9），令人驚喜的是，WSI19對(duì)α-麥芽糖酶具有較強(qiáng)的抑制作用，其IC50值為奧恬蘋的0.089倍，即同劑量的WSI19比奧恬蘋對(duì)α-麥芽糖酶的抑制性強(qiáng)11.2倍。說明WSI19不僅可以抑制α-淀粉酶，還可以抑制α-雙糖酶，屬于α-糖苷酶抑制劑。

2.4α-淀粉酶抑制劑WSI19的應(yīng)用

為了確認(rèn)WSI19是否確實(shí)能對(duì)哺乳動(dòng)物有降血糖效果，又設(shè)計(jì)了小鼠糖耐量實(shí)驗(yàn)，觀察給藥2h內(nèi)的血糖水平變化。對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)采集的血樣進(jìn)行血糖水平測定，以時(shí)間為橫坐標(biāo)、血糖值為縱坐標(biāo)繪制血糖水平變化曲線（圖10）。結(jié)果顯示，空白組小鼠在淀粉灌胃后血糖便開始急速升高，30min后達(dá)到最高值，約120min后便降到空腹水平，而給予不同種α-淀粉酶抑制劑的3組小鼠中，血糖高峰有了明顯的抑制和延遲，30min時(shí)空白對(duì)照組和其他三組之間的血糖值存在顯著差異（P < 0.01）；對(duì)于拜糖蘋組、奧恬蘋組和WSI19組來講，30min時(shí)血糖水平大致相同，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析無顯著性差異。即WSI19可以有效降低健康小鼠的餐后血糖水平，且與市售藥物效果相當(dāng)。

圖9　WSI19和奧恬蘋對(duì)α-麥芽糖酶的劑量依賴抑制曲線

圖10　α-淀粉酶抑制劑WSI19對(duì)小鼠糖耐量的影響

3　結(jié)論

α-淀粉酶抑制劑活性測定方法較多，但碘-淀粉比色法和DNS比色法多用于α-淀粉酶抑制劑的篩選。碘-淀粉比色法一般只能定性地測定α-淀粉酶抑制劑是否具有活性及活性相對(duì)的高低。無論是淀粉水瓊脂平板篩選模型還是淀粉溶液篩選模型都不能精確地測定抑制率的大小，只能起到初篩的作用。因?yàn)榈矸鬯傊桨搴Y選模型中，水解圈大小很難精確測量；淀粉溶液篩選模型，很難精確地控制反應(yīng)時(shí)間。在逐個(gè)加入碘液的過程中，α-淀粉酶催化淀粉水解仍在進(jìn)行，測量結(jié)果便會(huì)有誤差。針對(duì)不能精確控制時(shí)間的問題，本實(shí)驗(yàn)選擇待反應(yīng)時(shí)間達(dá)到15min時(shí)，立即將反應(yīng)體系至于冰水浴中，使反應(yīng)盡快停止，但并不能完全解決該問題，故此方法不能一次測定太多樣品液。

在應(yīng)用DNS法測定α-淀粉酶活性實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，雖然考慮到系統(tǒng)反應(yīng)后A值在0.6～1.4范圍內(nèi)有利于抑制劑活性強(qiáng)弱的比較，但是由于本實(shí)驗(yàn)的At是At1?At2的結(jié)果，故At值大部分在0.5以下，最小的At值僅為0.084。所以有以下缺點(diǎn)：α-淀粉酶對(duì)測定系統(tǒng)本底A值的影響接近0.012，本底A值對(duì)于最終At影響較大。

通過對(duì)菌株WS19發(fā)酵液中提取的α-淀粉酶抑制劑WSI19的酶學(xué)分析，結(jié)果顯示，WSI19對(duì)α-淀粉酶和α-麥芽糖酶都有顯著的抑制作用，且對(duì)α-麥芽糖酶的抑制性較強(qiáng)，比同劑量的奧恬蘋抑制性強(qiáng)11.2倍。通過小鼠糖耐量實(shí)驗(yàn)，證明WSI19對(duì)小鼠餐后血糖升高有一定抑制作用。

通常α-淀粉酶抑制劑類降糖藥物副作用相對(duì)較大，對(duì)α-淀粉酶抑制性弱且對(duì)雙糖酶抑制性強(qiáng)的糖苷酶抑制劑類藥物將會(huì)更符合病人的要求[13]。因此，WSI19具有很好的市場前景，具有開發(fā)治療二型糖尿病藥物的潛力，為糖尿病病人帶來更多的便利，具有很好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)效益。

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研究開發(fā)

研究開發(fā)

Screening of endophytic actinomycetes from medical plants with producing α-amylase inhibitor

WANG Shun，GAO Ruichang
（School of Chemical Engineering and Technology，Tianjin University，Tianjin 300072，China）

Abstract：α-amylase inhibitor is a kind of glycosidase inhibitors.It can inhibit the activity of ptyalase and amylopsin，prevent the hydrolysis and digestion of carbohydrates，reduce the intake of sugar，so that depress postprandial blood glucose level.In this paper，the α-amylase inhibitory activity of the mycelium extracts and broth of 70 endophytic actinomycetes associated with medicinal plants was detected with rapid and sensitive colorimetry.The results showed that，there are 19 strains having the ability to produce extracellular α-amylase inhibitor，6 of them having more than 70% inhibion rate; there are 16 strains having the ability to produce intracellular α-amylase inhibitor，3 of them having more than 70% inhibion rate; there are 7 strains having the ability to produce both extracellular and intracellular α-amylase inhibitor.The α-amylase inhibitor WSI19 was isolated and purified from the strain WS19，it could efficaciously inhibit α-amylase and α-maltase，and the inhibition of maltase is stronger than the same dose of miglitol 11.2 times.The glucose tolerance test in mice confirmed that WSI19 could significantly depress blood glucose levels.In a word，endophytic actinomycetes from medical plants have a better potential to produce α-amylase inhibitor，and could be developed to a possible therapeutic agent for diabetes.

Key words：α-amylase inhibitor; endophytic actinomycetes; activity; screening

收稿日期：2014- 05-20；

DOI：10.16085/j.issn.1000-6613.2015.02.031

文章編號(hào)：1000–6613（2015）02–0500–09

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

中圖分類號(hào)：Q 936

修改稿日期：2014-06-05。