蔡志強(qiáng)，侯 旭，張 波，劉若燦

(沈陽(yáng)工業(yè)大學(xué)石油化工學(xué)院，遼寧遼陽(yáng) 111003)

達(dá)比加群酯是一種新型的凝血酶抑制劑，用于口服的前體藥物，屬非肽類凝血酶抑制劑。其母核中苯并咪唑所連的芳環(huán)取代的脒基造成了藥物的溶解性差和口服生物利用度低等缺點(diǎn)［1－4］，限制了其藥效的充分發(fā)揮。為獲得活性更強(qiáng)，溶解性和生物利用度更佳的苯并咪唑類藥物，本文整合了雷扎沙班及其類似物的設(shè)計(jì)理念，采用苯甲脒基環(huán)合形成苯并異惡唑，并將其另外一端側(cè)鏈用氨基酸取代的方法優(yōu)化其結(jié)構(gòu)，增大化合物透膜吸收從而改善其藥物代謝，并考察其構(gòu)效關(guān)系。

Scheme 1

在文獻(xiàn)［5－10］方法的基礎(chǔ)上，本文以 3-［(3-氨基-4-甲基氨基苯甲酰)吡啶-2-基氨基］丙酸乙酯(1)為原料，與4-氰基-3-氟苯取代基乙酸(2a，2e)經(jīng)環(huán)化反應(yīng)制得 3-【【2-{［(4-氰基-3-氟苯取代基)甲基］-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-基}羰基】吡啶-2-基】氨基丙酸乙酯(3a和3e);3a和3e分別經(jīng)水解和酰胺化反應(yīng)制得 3-【【【2-{［(4-氰基-3-氟苯基)取代基］甲基}-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-基】羰基】吡啶-2-基氨基】丙酰取代胺基(6a～6h);6與乙酰氧肟酸經(jīng)環(huán)合反應(yīng)合成了8個(gè)新型的苯并咪唑衍生物7a～7h(Scheme 1)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR和HR-ESI-MS表征。并測(cè)定了7a～7h的抗凝血活性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Bruker ARX-400 MHz型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo));Agient1100型四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀;Bruker micro-TOF型高分辨質(zhì)譜儀。

1按文獻(xiàn)［5］方法制備;其余所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1)3a和3e的合成(以3a為例)

在反應(yīng)瓶中依次加入2-［(4-氰基-3-氟苯基)氨基］乙酸(2a)1.94 g(10 mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)1.9 g，1-羥基苯并三唑(HOBt)1.35 g，THF 35 mL和DMF 5 mL，冰水浴冷卻，攪拌反應(yīng)30 min。升至室溫，緩慢滴加1 3.1 g(9 mmol)的 THF(15 mL)溶液，滴畢，反應(yīng)6 h。除溶，加入二氯甲烷30 mL，用飽和鹽水(3×15 mL)洗滌，無(wú)水硫酸鎂干燥。過(guò)濾，濾液濃縮至干;剩余物中加入冰乙酸45 mL，回流反應(yīng)2 h。減壓濃縮至干，加入濃氨水15 mL，攪拌下于室溫反應(yīng)30 min。除溶，加入二氯甲烷25 mL，用飽和食鹽水(3×15 mL)洗滌，無(wú)水硫酸鎂干燥。過(guò)濾，濾液濃縮后經(jīng)柱色譜［洗脫劑:A=V(CH2Cl2)∶V(MeOH)=20 ∶1］純化得淡黃色固體3a 3.30 g，產(chǎn)率 72.8%;1H NMR δ:1.12(t，J=7.2 Hz，3H)，2.69(t，J=7.2 Hz，2H)，3.76(s，3H)，3.98(q，J=7.2 Hz，2H)，4.21(t，J=7.2 Hz，2H)，4.63(d，J=4.4 Hz，2H)，6.84 ～6.89(m，3H)，7.11 ～7.15(m，2H)，7.38 ～7.58(m，3H)，7.67(d，J=8.4 Hz，2H)，8.37(d，J=2.8 Hz，1H);ESI-MS m/z:501.3{［M+H］+}。

用類似方法合成土棕色固體3e。

(2)4a和4e的合成(以4a為例)

在反應(yīng)瓶中加入3a 2.42 g(1.5 mmol)和乙醇30 mL，攪拌使其溶解;滴加氫氧化鈉0.32 g(8 mmol)溶液5 mL，滴畢，反應(yīng)3 h。蒸除1/3體積溶劑，用稀鹽酸調(diào)至pH 6。過(guò)濾，濾餅干燥得白色固體 4a 1.82 g，產(chǎn)率 79.7%;1H NMR δ:2.69(t，J=7.2 Hz，2H)，3.76(s，3H)，3.98(q，J=7.2 Hz，2H)，4.63(d，J=4.4 Hz，2H)，6.84 ～6.89(m，3H)，7.11 ～ 7.15(m，2H)，7.38 ～7.58(m，3H)，7.67(d，J=8.4 Hz，2H)，8.37(d，J=2.8 Hz，1H)，11.96(br，1H);ESIMS m/z:473.2{［M+H］+}。

用類似方法合成白色固體4e。

(3)6a～6h的合成(以6a為例)

在反應(yīng)瓶中加入4a 4.72 g(0.01 mol)，EDCI 1.9 g，HOBt 1.35 g，碳酸鉀 1.38 g 和 DMF 25 mL，攪拌使其溶解;于冰水浴中反應(yīng)1 h;升至室溫，加入纈氨酸甲酯(5a)鹽酸鹽 1.68 g(10 mmol)，反應(yīng)6 h。除溶，加入二氯甲烷20 mL，用飽和鹽水(3×10 mL)洗滌，無(wú)水硫酸鎂干燥。過(guò)濾，濾液濃縮后經(jīng)柱色譜(洗脫劑:A=25∶1)純化得淡黃色固體 6a 3.60 g，產(chǎn)率61.5%;1H NMR δ:0.88(d，J=6.8 Hz，6H)，2.32(m，1H)，2.69(t，J=7.2 Hz，2H)，3.70(s，3H)，3.74(s，3H)，3.98(q，J=7.2 Hz，2H)，4.25(d，J=7.2 Hz，1H)，4.63(d，J=4.4 Hz，2H)，6.84 ～6.89(m，3H)，7.11 ～ 7.15(m，2H)，7.38 ～7.58(m，3H)，7.67(d，J=8.4 Hz，2H)，8.37(d，J=2.8 Hz，1H);ESI-MS m/z:586.1{［M+H］+}。

用類似方法合成灰白色固體6b～6h。

(4)3-【2-{［(3-氨基苯基異惡唑-6-基)取代基］甲基}-1-甲基-N-(吡啶-2-基)-1H-苯并咪唑-5-羰基】丙酰取代基(7a～7h)的合成(以7a為例)

在反應(yīng)瓶中加入6a 5.85 g(10 mmol)，碳酸鉀6.50 g，DMF 100 mL 和水 30 mL，攪拌使其溶解;分批加入乙酰氧肟酸2.04 g(30 mmol)，加畢，反應(yīng)12 h。過(guò)濾，濾液濃縮至干后經(jīng)柱色譜(洗脫劑:A=30∶1)純化得白色固體7a 4.20 g。

用類似方法合成白色固體7b～7h。

7a:產(chǎn)率 70.2%;1H NMR δ:0.83(d，J=6.8 Hz，6H)，2.32(m，1H)，2.64(t，J=7.2 Hz，2H)，3.71(s，3H)，3.78(s，3H)，3.94(q，J=7.2 Hz，2H)，4.22(d，J=7.2 Hz，1H)，4.58(d，J=4.4 Hz，2H)，6.81 ～6.88(m，3H)，7.10 ～ 7.19(m，2H)，7.33 ～ 7.55(m，3H)，7.64(d，J=8.4 Hz，2H)，8.39(d，J=2.8 Hz，1H)，8.56(br，2H);ESI-MS m/z:599.4{［M+H］+};HR-ESI-MS m/z:Calcd for C31H34N8O5{［M+H］+}599.660 2，found 599.661 7。

7b:產(chǎn)率 48.8%;1H NMR δ:2.62(t，J=7.2 Hz，2H)，3.69(s，3H)，3.78(s，3H)，3.94(q，J=7.2 Hz，2H)，4.19(d，J=7.2 Hz，2H)，4.58(d，J=4.4 Hz，2H)，6.81 ～6.88(m，3H)，7.10 ～ 7.19(m，2H)，7.33 ～ 7.55(m，3H)，7.64(d，J=8.4 Hz，2H)，8.39(d，J=2.8 Hz，1H)，8.56(br，2H);ESI-MS m/z:557.3{［M+H］+};HR-ESI-MS m/z:Calcd for C28H28N8O5{［M+H］+}557.580 5，found 557.582 7。

7c:產(chǎn)率 72.5%;1H NMR δ:0.85(d，J=6.8 Hz，3H)，2.62(t，J=7.2 Hz，2H)，3.70(s，3H)，3.77(s，3H)，3.92(q，J=7.2 Hz，2H)，4.21(d，J=7.2 Hz，1H)，4.54(d，J=4.4 Hz，2H)，6.81 ～6.88(m，3H)，7.14 ～7.19(m，2H)，7.33 ～7.52(m，3H)，7.60(d，J=8.4 Hz，2H)，8.37(d，J=2.8 Hz，1H)，8.53(br，2H);ESI-MS m/z:571.1{［M+H］+};HR-ESI-MS m/z:Calcd for C29H30N8O5{［M+H］+}571.241 7，found 571.240 2。

7d:產(chǎn)率 44.0%;1H NMR δ:0.91(d，J=6.8 Hz，6H)，1.56(m，1H)，1.99(m，2H)，2.64(t，J=7.2 Hz，2H)，3.71(s，3H)，3.78(s，3H)，3.94(q，J=7.2 Hz，2H)，4.42(d，J=7.2 Hz，1H)，4.58(d，J=4.4 Hz，2H)，6.81 ～6.88(m，3H)，7.10 ～ 7.19(m，2H)，7.33 ～7.55(m，3H)，7.61(d，J=8.4 Hz，2H)，8.22(d，J=2.8 Hz，1H)，8.46(br，2H);ESIMS m/z:613.4{［M+H］+};HR-ESI-MS m/z:Calcd for C32H36N8O5{［M+H］+}613.686 8，found 613.684 6。

7e:產(chǎn)率 65.2%;1H NMR δ:0.86(d，J=6.8 Hz，6H)，2.32(m，1H)，2.66(t，J=7.2 Hz，2H)，3.75(s，3H)，3.79(s，3H)，3.91(q，J=7.2 Hz，2H)，4.22(d，J=7.2 Hz，1H)，4.55(d，J=4.4 Hz，2H)，6.81 ～6.88(m，3H)，7.10 ～ 7.19(m，2H)，7.34 ～ 7.55(m，3H)，7.64(d，J=8.4 Hz，2H)，8.35(d，J=2.8 Hz，1H)，8.50(br，2H);ESI-MS m/z:600.3{［M+H］+};HR-ESI-MS m/z:Calcd for C31H33N7O6{［M+H］+}600.645 0，found 600.643 3。

7f:產(chǎn)率 36.9%;1H NMR δ:2.58(t，J=7.2 Hz，2H)，3.65(s，3H)，3.78(s，3H)，3.91(q，J=7.2 Hz，2H)，4.14(d，J=7.2 Hz，2H)，4.55(d，J=4.4 Hz，2H)，6.82 ～6.84(m，3H)，7.13 ～ 7.17(m，2H)，7.30 ～ 7.58(m，3H)，7.61(d，J=8.4 Hz，2H)，8.35(d，J=2.8 Hz，1H)，8.50(br，2H);ESI-MS m/z:558.2{［M+H］+};HR-ESI-MS m/z:Calcd for C28H27N7O6{［M+H］+}558.565 2，found 558.564 5。

7g:產(chǎn)率 46.7%;1H NMR δ:0.86(d，J=6.8 Hz，3H)，2.61(t，J=7.2 Hz，2H)，3.73(s，3H)，3.79(s，3H)，3.92(q，J=7.2 Hz，2H)，4.21(d，J=7.2Hz，1H)，4.54(d，J=4.4 Hz，2H)，6.81 ～6.88(m，3H)，7.14 ～7.19(m，2H)，7.33 ～7.52(m，3H)，7.62(d，J=8.4 Hz，2H)，8.31(d，J=2.8 Hz，1H)，8.53(br，2H);ESI-MS m/z:572.3{［M+H］+};HR-ESI-MS m/z:Calcd for C29H29N7O6{［M+H］+}572.591 8，found 572.590 9。

7h:產(chǎn)率26.8%;1H NMR δ:0.94(d，J=6.8 Hz，6H)，1.50(m，1H)，1.92(m，2H)，2.63(t，J=7.2 Hz，2H)，3.76(s，3H)，3.82(s，3H)，3.93(q，J=7.2 Hz，2H)，4.41(d，J=7.2 Hz，1H)，4.52(d，J=4.4 Hz，2H)，6.84 ～6.89(m，3H)，7.12 ～7.17(m，2H)，7.32 ～7.56(m，3H)，7.66(d，J=8.4 Hz，2H)，8.24(d，J=2.8 Hz，1H)，8.48(br，2H);ESI-MS m/z:614.2{［M+H］+};HR-ESI-MS m/z:Calcd for C32H35N7O6{［M+H］+}614.671 5，found 614.670 8。

1.3 抗凝活性評(píng)價(jià)-活化部分凝血活酶時(shí)間的測(cè)定

將質(zhì)量18 g～20 g的昆明小鼠，隨機(jī)分組，每組10只，禁食過(guò)夜。將達(dá)比加群酯及7a～7h懸浮或溶解于1%的羧甲基纖維素鈉水溶液中，配成1 mg·mL－1的濃度，按 10 mg·Kg－1的劑量(折合成達(dá)比加群計(jì)算)灌胃給藥，30 min后通過(guò)心臟穿刺取血，加入4%枸杞酸鈉溶液至0.4%終濃度抗凝，12 000 r·min－1離心 5 min。取血漿0.1 mL，加入 aPTT 試劑 0.1 mL，于 37 ℃ 預(yù)溫 3 min，加入37℃氯化鈣溶液0.1 mL，用血小板聚集凝血因子分析儀測(cè)定凝固時(shí)間，即為aPTT值。

2 結(jié)果與討論

2.1 7 的合成

由于受到苯環(huán)對(duì)位雜原子的影響，7a～7d的產(chǎn)率明顯高于7e～7h。這可能由于其對(duì)位的LINKER雜原子氧的電負(fù)性大于氮的電負(fù)性，造成了環(huán)合時(shí)氰基鄰位的氟離去能力減弱，致使收率降低。其確切反應(yīng)機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

2.2 抗凝血活性與結(jié)構(gòu)的關(guān)系

7a～7h的抗凝血活性結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，7d與達(dá)比加群酯的抗凝血活性基本相當(dāng);7h的活性比生理鹽水的更弱，可能是因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)中所連的氧橋連與亮氨酸修飾后影響了其體內(nèi)的吸收。7c和7g的aPTT值雖然較高，但在臨床上容易出現(xiàn)出血的風(fēng)險(xiǎn);7a和7b既能延長(zhǎng)凝血時(shí)間，又不至于出現(xiàn)出血的風(fēng)險(xiǎn)，因此活性較好;而7e和7f略比達(dá)比加群酯稍差，其原因可能在于與其相連的LINKER由氮替換為氧，使整個(gè)分子過(guò)于柔性，改變了其原有的空間大體骨架走向。在苯芳環(huán)與咪唑芳環(huán)所連接的LINKER需要采用略顯剛性的氮橋連，可增強(qiáng)7對(duì)抗凝血活性，若連接過(guò)于柔性的氧橋連，則致使抗凝血活性明顯降低，其構(gòu)效關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

表1 7a～7h的抗凝活性Table 1 The inhibition activities of 7a～7h

3 結(jié)論

合成了8個(gè)新型的苯并咪唑類衍生物(7a～7h)?？鼓钚詫?shí)驗(yàn)結(jié)果表明:7a和7b的抗凝血活性最好，其aPTT值分別為(83.1±4.2)s和(80.7 ±2.9)s，優(yōu)于對(duì)照藥達(dá)比加群酯(75.3 ±2.1)s。

7a～7h的合成，對(duì)凝血抑制藥物的開(kāi)發(fā)具有重要意義。

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