何培新，吳雙雙，賀新生，許春平*

（1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.西南科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽(yáng) 621010）

0 引言

自Chihara 等[1]1969 年發(fā)現(xiàn)香菇多糖具有抗腫瘤活性和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能以來(lái)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)200 多種具有抗腫瘤活性的藥用真菌多糖[2-3].此外還發(fā)現(xiàn)真菌多糖具有降低血糖血脂、抗輻射、抗衰老、保肝護(hù)肝、抗氧化等多種生理功能[4]，使其成為國(guó)內(nèi)外醫(yī)藥與保健品行業(yè)研究與開發(fā)的熱點(diǎn).馬勃狀硬皮馬勃（Scleroderma areolatum Ehrenb），又名馬皮泡、灰包，屬于擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina），硬皮馬勃目（Sclerodermatales），硬皮馬勃科（Sclerodermataceae），硬皮馬勃屬（Scleroderma）.該屬真菌廣泛分布于世界各地，共有60 余種，在我國(guó)較常見(jiàn)的有11 種.硬皮馬勃幼嫩時(shí)可食用，并多有止血、消腫、清熱和解毒等藥用功效[5].馬勃狀硬皮馬勃的子實(shí)體水提液具有抑菌、抗炎、止咳、止血、殺蟲、抗?jié)兊茸饔肹6].該屬真菌具有很高的藥用價(jià)值，其部分化學(xué)成分國(guó)外已有相關(guān)報(bào)道[7]，其中一種新的羊毛甾烷型三萜化合物（lanostanetype triterpenoid）對(duì)單純皰疹病毒1 型（HSV-1）有顯著的抗病毒活性[8]，然而目前還沒(méi)有馬勃狀硬皮馬勃胞外多糖（EPS）的研究報(bào)道.

本研究對(duì)發(fā)酵罐制得的馬勃狀硬皮馬勃EPS進(jìn)行分離純化、結(jié)構(gòu)表征和抗氧化測(cè)定，為進(jìn)一步研究馬勃狀硬皮馬勃EPS 的構(gòu)效關(guān)系及其在醫(yī)藥行業(yè)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

馬勃狀硬皮馬勃試驗(yàn)菌株由野生子實(shí)體經(jīng)組織分離獲得，由西南科技大學(xué)賀新生教授提供.

1.1.2 發(fā)酵罐種子液的制備

用打孔器取平板邊緣新生菌絲兩塊，接入含50 mL 種子培養(yǎng)液的250 mL 錐形瓶中，160 r/min 26 ℃振蕩培養(yǎng)4 d.然后加入滅菌磁棒和玻璃珠，置于磁力攪拌器上將菌絲球打碎后備用.本研究所有接種量均固定為4%.

1.1.3 發(fā)酵培養(yǎng)條件

采用搖瓶?jī)?yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基：20.0 g/L 果糖，5.0 g/L 大豆粉，2.5 mmol/L KH2PO4，2.5 mmol/L MgSO4，pH 8.0；發(fā)酵培養(yǎng)溫度為26 ℃，攪拌速度160 r/min，進(jìn)氣量2 vvm；發(fā)酵罐容積為5 L，裝液量為3.5 L.

1.1.4 透析袋

采用分子截留量3 500、直徑22 mm、壓平寬度34 mm 的透析袋.

1.1.5 主要儀器

SW-CJ-2F 超凈工作臺(tái)：蘇凈安泰；5 L 攪拌式發(fā)酵罐：上海百倫科技有限公司；XFH-30CA 立式壓力蒸汽滅菌鍋：浙江新豐醫(yī)療器械有限公司；CPA224S 萬(wàn)分之一天平：賽多利斯；78-1SA 磁力攪拌器：上海企戈實(shí)業(yè)有限公司；CXG-1 電腦恒溫層析柜（含DLH-A 恒流泵，DBS-100 全自動(dòng)部份收集器）：上海青浦滬西儀器廠；SJIA-10N 冷凍干燥機(jī)：寧波雙嘉儀器有限公司；HZT-A1000 電子天平：上海嘉展儀器設(shè)備有限公司；UV-17001C 紫外分光光度計(jì)：上海鳳凰光學(xué)科儀有限公司；Sepharose CL-6B 層析柱：上海索萊寶生物技術(shù)公司；日本EYELA 全自動(dòng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀N-2100：東京理化；SHB-III 循環(huán)水多用真空泵：北京成萌偉業(yè)有限公司；Nicolet 5700 傅立葉變換紅外光譜儀：美國(guó)；尺寸排阻色譜-多角度激光光散射（SECMALLS）：美國(guó)懷亞特.

1.1.6 主要化學(xué)試劑

果糖、苯酚、濃硫酸、氯仿、正丁醇、無(wú)水乙醇、KH2PO4、MgSO4、NaNO3、NaN3、KBr、吡啶和甲醇等（分析純）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；大豆粉購(gòu)自蓮花市場(chǎng)；藍(lán)色葡聚糖2000、標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖（Dextran T10、T40、T70、T150）：上海玉博生物科技有限公司；Sepharose CL-6B：Solarbio 公司；三氟乙酸（色譜純）：阿拉丁試劑有限公司；三甲基氯硅烷（BSTFA∶TMCS，99∶1）（色譜純）：東京化成工業(yè)株式會(huì)社產(chǎn)品.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 從發(fā)酵液提取粗多糖

利用抽濾法[9]分離菌絲體和發(fā)酵液，將發(fā)酵液旋蒸濃縮至1/3，加入4 倍體積無(wú)水乙醇，4 ℃靜置過(guò)夜，然后10 000 r/min 離心15 min，得到粗多糖沉淀.

1.2.2 sevag 法除蛋白[10]

用少量蒸餾水溶解粗多糖，加入1/3 體積多糖溶液的除蛋白液(氯仿/正丁醇混合液，體積比為5∶1)，磁力攪拌30 min，然后于分液漏斗中靜置20 min，除去下層的有機(jī)相，保留水相；重復(fù)操作4～5次，直至有機(jī)相與水相間無(wú)明顯沉淀為止.將所有水相濃縮3 倍，加入4 倍體積無(wú)水乙醇，4 ℃靜置過(guò)夜后，10 000 r/min 離心15 min，得到粗多糖沉淀.粗多糖沉淀冷凍干燥即得粗胞外多糖.

1.2.3 粗胞外多糖的分離純化

稱量20 mg 粗多糖，溶解于2 mL 0.2 mol/L 的NaCl 溶液，用0.22 μm 孔徑的濾膜過(guò)濾，再進(jìn)行Sepharose CL-6B 柱層析.調(diào)整恒流泵使洗脫液流速為1.15 mL/min，利用自動(dòng)收集器收集.從每管取1 mL 收集液，用苯酚硫酸法[11]于490 nm 處檢測(cè)多糖，于280 nm 處直接檢測(cè)收集液的蛋白，記錄吸光度值.以管數(shù)為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制粗多糖純化曲線.重復(fù)過(guò)層析柱8～10 次，將同一組分的多糖收集在一起，濃縮后用分子截留量為3 500 的透析袋透析3 d，每天換蒸餾水3 次.最后將透析過(guò)的精制胞外多糖冷凍干燥，置干燥器中備用.

1.2.4 凝膠過(guò)濾法測(cè)胞外多糖的相對(duì)分子質(zhì)量[12]

用0.2 mol/L NaCl 溶液平衡Sepharose CL-6B層析柱24 h 后，先用藍(lán)色葡聚糖2 000 加入柱內(nèi)測(cè)得外水體積V0，然后取2 mL 質(zhì)量濃度為2 mg/mL 的分子質(zhì)量不同的標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖（Dextran T10、T40、T70、T150）分別相繼上樣，調(diào)整恒流泵使洗脫液流速為1.15 mL/min，利用自動(dòng)收集器收集.用苯酚硫酸法檢測(cè)吸光度值，合并洗脫液，分別求得洗脫體積Ve.凝膠柱所能容納的總體積定為Vt，其計(jì)算方法見(jiàn)公式（1）.以各標(biāo)準(zhǔn)多糖的分配系數(shù)Kav值為橫坐標(biāo)，以分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線.Kav的計(jì)算公式見(jiàn)（2）.

式中：D 為層析柱直徑，h 為層析柱高，Ve為洗脫體積，V0為外水體積，Vt為柱床總體積.

按上述方法測(cè)得真菌胞外多糖的Ve，由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得其相對(duì)分子質(zhì)量.

1.2.5 精制EPS 的紅外光譜（IR）測(cè)定

稱取2～3 mg 精制EPS，加入適量的KBr，研磨均勻后壓片，用傅立葉變換紅外光譜儀在4 000～400 cm-1波長(zhǎng)區(qū)間內(nèi)掃描紅外吸收值[13].

1.2.6 精制EPS 的氣相色譜/質(zhì)譜（GC/MS）測(cè)定

稱取精制EPS 3 mg，放入棕色小瓶中，加入3 mL 2 mol/L 的三氟乙酸，密封后置于121 ℃的烘箱中恒溫2 h.冷卻后用0.22 μm 的水相濾膜過(guò)濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸干，然后加入2～3 mL 甲醇再次蒸干，重復(fù)3 次.加入1.5 mL 吡啶和0.1 mL 衍生試劑BSTFA∶TMCA（99∶1），密封后置于80 ℃的烘箱中恒溫1 h，冷卻后過(guò)0.22 μm 的有機(jī)濾膜，送樣檢測(cè)[14].

上樣條件：HP-5 MS 60 m 色譜柱，進(jìn)樣量0.1 μL，分流比100∶1，延遲時(shí)間7 min，進(jìn)樣口溫度280 ℃，傳輸線溫度280 ℃.升溫程序?yàn)椋浩鹗紲囟?0 ℃，保持2 min，以5 ℃/min 的速度升溫至280 ℃，保持20 min.MS 分析條件：溶劑延遲7 min，掃描范圍35～455 aum，進(jìn)樣口280 ℃，傳輸線溫度280 ℃，EI 能量70 eV，離子源溫度230 ℃，四級(jí)桿溫度160 ℃.

1.2.7 SEC/MALLS 測(cè)定精制EPS 的相對(duì)分子質(zhì)量及分子構(gòu)象

尺寸排阻色譜（SEC）、多角度激光光散射檢測(cè)器（MALLS）及示差折光檢測(cè)器（RI）聯(lián)用可測(cè)定精制EPS 相對(duì)分子質(zhì)量的大小及分子構(gòu)象[15].

使用50 mmol/L NaNO3和0.02% NaN3溶解精制EPS 樣品，配制成2 mg/mL 的樣品溶液，用0.22 μm 的水相膜過(guò)濾后備用.流速0.5 mL/min，進(jìn)樣量100 μL，樣品的dn/dc 值根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)置為0.14 mL/g[16].使用軟件Astra 4.72（美國(guó)懷亞特技術(shù)公司）計(jì)算樣品的相對(duì)分子質(zhì)量大小和均方根的回轉(zhuǎn)半徑.從均方根半徑與樣品相對(duì)分子質(zhì)量的雙對(duì)數(shù)曲線中，可以判斷多糖分子在水溶液中的構(gòu)象，具體條件由下列公式給出：

式中：ri是樣品的均方根半徑，Mi是樣品的分子質(zhì)量，k 是均方根半徑在Y 軸的截距，1/3、1/2 和1 分別代表樣品不同構(gòu)象的臨界坡度值.

1.2.8 精制EPS 黏度的測(cè)定[17]

EPS 的黏度用烏氏黏度計(jì)在（25±0.1）℃的水浴中進(jìn)行測(cè)定.選擇溶劑流出毛細(xì)管時(shí)間大于120 s 的黏度計(jì)，由此可忽略動(dòng)能校正.用逐步稀釋法按以下的Huggins 方程（3）和Kraemer 方程（4），將濃度外推至零計(jì)算特性黏度[η]:

其中，k’和β 為多糖在某溫度下某溶劑中的常數(shù)，ηsp/c 為比濃黏度，lnηr/c 為比濃對(duì)數(shù)黏度.

1.2.9 精制EPS 均方根旋轉(zhuǎn)半徑（Rg）和流體力學(xué)半徑（Rh）的測(cè)定[18]

分子質(zhì)量中心到各質(zhì)點(diǎn)（基團(tuán)）距離平方的平均值的平方根被定義為均方根旋轉(zhuǎn)半徑（Rg），它反映單個(gè)高分子分子鏈在空間的伸展程度.流體力學(xué)半徑（Rh）反映流體力學(xué)作用時(shí)大分子在溶液中的尺寸，它是一個(gè)與高聚物鏈有相同平移擴(kuò)散系數(shù)的等效球體的半徑[19].Rg通過(guò)SEC-MALLS 法測(cè)得，而Rh通過(guò)黏度法獲得，根據(jù)Einstein 理論公式（5）[20]推算得：

式中：NA為阿伏伽德羅常數(shù)（6.022×1023），Mw和[η]分別為重均分子質(zhì)量和特性黏度.

均方旋轉(zhuǎn)半徑和流體力學(xué)半徑的比值可以用ρ 表示：

1.2.10 鄰二氮菲法測(cè)定EPS 對(duì)·OH 的清除能力[21]

配制質(zhì)量濃度梯度分別為2 mg/mL、4 mg/mL、6 mg/mL、8 mg/mL、10 mg/mL 的EPS 溶液10 mL.取7 支試管，其中5 支為試驗(yàn)組，1 支作為對(duì)照組，1 支為調(diào)零組.向試驗(yàn)組中加入1 mL pH 為7.4 的磷酸緩沖液（0.02 mmol/L，PBS），1 mL 7.5 mmol/L的鄰二氮菲溶液，1 mL 3.25 mmol/L FeSO4溶液，1 mL 1.5%H2O2，EPS 溶液2 mL.調(diào)零組以蒸餾水代替2 mL EPS 溶液，對(duì)照組以蒸餾水代替2 mL EPS 溶液和1 mL 1.5%H2O2.混勻后，于37 ℃恒溫1 h.調(diào)零組調(diào)零后，用紫外分光光度計(jì)于510 nm處測(cè)定試驗(yàn)組和對(duì)照組的吸光度值.每組做3 次平行試驗(yàn)，取其平均值.EPS 對(duì)·OH 清除率的計(jì)算公式如下：

式中：Ai是試驗(yàn)組的吸光度值，Aj是對(duì)照組的吸光度值.

1.2.11 EPS 對(duì)·DPPH 清除能力的測(cè)定[22]

配制質(zhì)量濃度梯度為1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL 的EPS 溶液20 mL.取11 支試管，5 支為試驗(yàn)組，5 支為對(duì)照組，1 支為空白組.向試驗(yàn)組分別加入2 mL EPS 溶液、2 mL 0.1 g/L 的DPPH 50%乙醇溶液，混勻后，于25 ℃恒溫1 h，以50%乙醇溶液為空白于517 nm 處測(cè)定其吸光度Ai；向空白組分別加入2 mL 0.1 g/L的DPPH 50%乙醇溶液、2 mL 蒸餾水，混勻后于25 ℃水浴中放置1 h，于517 nm 處測(cè)定其吸光度A0；向?qū)φ战M分別加入2 mL EPS 溶液、2 mL 50%乙醇，混勻后于25 ℃恒溫1 h，于517 nm 處測(cè)定其吸光度Aj.EPS 對(duì)·DPPH 清除率的計(jì)算公式如下：

式中：Ai是試驗(yàn)組的吸光度值，Aj是對(duì)照組的吸光度值，A0是空白組的吸光度值.

2 結(jié)果與討論

2.1 馬勃狀硬皮馬勃EPS 的分離純化

發(fā)酵罐發(fā)酵馬勃狀硬皮馬勃所產(chǎn)EPS 經(jīng)除蛋白后，通過(guò)Sepharose CL-6B 柱層析進(jìn)行分離純化，結(jié)果如圖1 所示.通過(guò)分析可知，馬勃狀硬皮馬勃粗多糖純化時(shí)有兩個(gè)多糖吸收峰，即兩個(gè)組分（Fr-I 和Fr-II）.Fr-I 為13～35 管，F(xiàn)r-II 為36～45 管，對(duì)這兩個(gè)組分的管數(shù)分別進(jìn)行收集，透析袋透析，然后冷凍干燥，即得精制多糖.而且可以看出，蛋白吸收峰在兩個(gè)多糖吸收峰中都有，說(shuō)明其精制多糖的兩個(gè)組分均可能含有蛋白.

圖1 馬勃狀硬皮馬勃產(chǎn)EPS 分離純化結(jié)果Fig.1 The separation and purification of EPS from S.areolatum Ehrenb

2.2 馬勃狀硬皮馬勃EPS 的相對(duì)分子質(zhì)量

以Kav為橫坐標(biāo)，葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品系列的logM為縱坐標(biāo)，繪得分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=-5.485 8x+6.537 9，相關(guān)性系數(shù)為R2=0.999 3.由標(biāo)準(zhǔn)曲線推算得馬勃狀硬皮馬勃EPS 精制組分的相對(duì)分子質(zhì)量，結(jié)果如圖2 所示.試驗(yàn)測(cè)得馬勃狀硬皮馬勃EPSFr-I 和Fr-II 的Ve分別為115 mL 和195 mL，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線推算得馬勃狀硬皮馬勃EPS Fr-I 和Fr-II 組分的相對(duì)分子質(zhì)量分別為627 500 和4 820.

2.3 馬勃狀硬皮馬勃EPS 的紅外光譜分析

圖2 馬勃狀硬皮馬勃EPS 精制組分的相對(duì)分子質(zhì)量Fig.2 The relative molecular weight of EPS refined fractions from S.areolatum Ehrenb

圖3 馬勃狀硬皮馬勃EPS 精制組分的紅外光譜Fig.3 The RT-IR spectra of EPS refined fractions from S.areolatum Ehrenb

馬勃狀硬皮馬勃產(chǎn)EPS Fr-I 和Fr-II 的紅外光譜圖如圖3 所示.通過(guò)分析可知，馬勃狀硬皮馬勃EPS Fr-I 在3 299.4 cm-1有寬展圓滑強(qiáng)吸收峰，為O—H 伸縮振動(dòng)，說(shuō)明其分子氫鍵以分子間氫鍵為主；2 930.4 cm-1處有較強(qiáng)吸收峰是由多糖中甲基—CH3或次甲基—CH2的C—H 的伸縮振動(dòng)引起的，具有典型的多糖特征；在1 650.8 cm-1處出現(xiàn)紅外吸收峰，為N—H 的變角振動(dòng)，為氨基或酰胺基的結(jié)構(gòu)[23]；1 386.2 cm-1處的紅外吸收峰為磺?；狾—SO2—R 的S ＝O 非對(duì)稱伸縮振動(dòng)；1 123.8 cm-1處有紅外吸收峰，為C—O—C 環(huán)內(nèi)醚的C—O 伸縮振動(dòng)；1 020.5 cm-1處的紅外吸收峰為—OH 的O—H 變角振動(dòng)；在970.1 cm-1處出現(xiàn)紅外吸收峰，此處為吡喃環(huán)末端次甲基的橫搖振動(dòng)；916.9 cm-1處出現(xiàn)紅外吸收峰，為α-吡喃糖的特征吸收峰；810.9 cm-1處的紅外吸收峰為甘露糖特征吸收峰[24].因此可以推測(cè)其Fr-I 可能是α-吡喃型甘露糖苷酸性雜多糖[25].馬勃狀硬皮馬勃EPS Fr-II 與Fr-I 不同的是在1 241.5 cm-1處有吸收峰，說(shuō)明有酯基或O—乙?；拇嬖冢粵](méi)有C—O—C 環(huán)內(nèi)醚的C—O 伸縮振動(dòng)；經(jīng)分析可以得出其Fr-II 可能也是α-吡喃型甘露糖苷酸性雜多糖.

2.4 馬勃狀硬皮馬勃EPS 單糖組分分析

將馬勃狀硬皮馬勃EPS 的各精制組分分別進(jìn)行GC/MS 檢測(cè)，把各個(gè)組分的氣相色譜圖中每個(gè)峰的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)單糖的保留時(shí)間進(jìn)行比對(duì).分別對(duì)馬勃狀硬皮馬勃EPS 精制組分的氣相色譜圖進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4 所示.

采用面積歸一化法對(duì)馬勃狀硬皮馬勃EPS 單糖組分進(jìn)行分析，分析結(jié)果如表1 所示，其Fr-I 和Fr-II 所含單糖組分和含量分別為：鼠李糖0.86%、1.99%，核糖5.35%、8.36%，木糖9.81%、3.77%，葡萄糖醛酸47.35%、35.05%，半乳糖2.21%、2.82 %，葡萄糖4.21%、7.50%，甘露糖29.70%、33.79 %，半乳糖醛酸0.51%、6.72%，兩個(gè)組分所含單糖組分的種類一樣，含量有所差異.馬勃狀硬皮馬勃EPS各精制組分均含有葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，說(shuō)明發(fā)酵所得的EPS 可能為酸性多糖[25-26]，與其紅外光譜分析結(jié)果一致；其單糖組分中甘露糖的含量較多，與紅外光譜中810 cm-1處出現(xiàn)的甘露糖特征吸收峰一致.

圖4 馬勃狀硬皮馬勃EPS 精制組分氣相色譜圖（上：Fr-I，下：Fr-II）Fig.4 The GC of EPS refined fractions from S.areolatum Ehrenb（top:Fr-I，under:Fr-II）

2.5 馬勃狀硬皮馬勃EPS 的SEC/MALLS 分析

利用尺寸排阻色譜（SEC）、多角度激光光散射檢測(cè)器（MALLS）及示差折光檢測(cè)器（RI）聯(lián)用技術(shù)，可檢測(cè)馬勃狀硬皮馬勃EPS 精制組分的分子質(zhì)量及其在水溶液中的分布情況，結(jié)果如表2 所示.

分析表2 可知，馬勃狀硬皮馬勃EPS Fr-I 和Fr-II 的重均分子質(zhì)量分別為1.332×105和1.198×105，Mw/Mn即多分散系數(shù)分別為4.797 和2.996，表明兩個(gè)組分的分散性均很低，在水溶液中很容易形成大量的聚集體，溶解度很小.馬勃狀硬皮馬勃EPSFr-I 和Fr-II 的均方根半徑分別為22.0 nm 和12.8 nm，F(xiàn)r-I 和Fr-II 的均方根半徑對(duì)分子質(zhì)量的雙對(duì)數(shù)曲線的斜率分別為0.13 和0.15（圖5），說(shuō)明其在水溶液中以球形構(gòu)象存在，是一種高度緊密而且具有分支結(jié)構(gòu)的多糖聚集體.通過(guò)SEC/MALLS 測(cè)得馬勃狀硬皮馬勃產(chǎn)EPSFr-II 的相對(duì)分子質(zhì)量大于凝膠過(guò)濾法測(cè)得的相對(duì)分子質(zhì)量，這可能是因?yàn)榫贫嗵墙?jīng)過(guò)透析時(shí)多糖分子發(fā)生了聚集，溶解度降低所致.馬勃狀硬皮馬勃產(chǎn)EPS 精制組分Fr-I（左）和Fr-II（右）的均方根半徑對(duì)相對(duì)分子質(zhì)量的雙對(duì)數(shù)曲線如圖5 所示.

表2 馬勃狀硬皮馬勃EPS 精制組分SEC/MALLS 參數(shù)Table 2 The SEC/MALLS parameters of EPS refined fractions from S.areolatum Ehrenb

圖5 馬勃狀硬皮馬勃EPS 精制組分均方根半徑對(duì)分子質(zhì)量的雙對(duì)數(shù)曲線（上：Fr-I，下：Fr-II）Fig.5 The double logarithmic curve of root mean square radius vs molecular weight for EPS refined fractions from S.areolatum Ehrenb（top:Fr-I，umder:Fr-II）

2.6 馬勃狀硬皮馬勃EPS 的分子構(gòu)象分析

馬勃狀硬皮馬勃EPS 分子構(gòu)象的參數(shù)如表3所示，其中Mw和Rg值通過(guò)SEC-MALLS 法測(cè)得，而Rh通過(guò)黏度法獲得，根據(jù)Einstein 理論公式推算得到.黏度由烏氏黏度計(jì)測(cè)定，它反映了在稀溶液中多糖所占的水力體積.通常認(rèn)為，黏度越小，多糖往往具有比較致密的構(gòu)象[27].由表3 可知，試驗(yàn)測(cè)得馬勃狀硬皮馬勃EPS Fr-II 的黏度值較Fr-I小，而且其相對(duì)分子質(zhì)量和均方旋轉(zhuǎn)半徑均較Fr-I的小，尤其是均方旋轉(zhuǎn)半徑非常小，說(shuō)明其鏈未舒展開，結(jié)構(gòu)較為致密.

表3 馬勃狀硬皮馬勃EPS 精制組分的分子構(gòu)象參數(shù)Table 3 The molecular conformation parameters of EPS refined fractions from S.areolatum Ehrenb

k’值在0.3～0.5 之間時(shí)，表明該溶液對(duì)聚合物是良溶劑.由表3 可知，馬勃狀硬皮馬勃EPS 各精制組分的k’均大于0.5，說(shuō)明其在水溶液中的溶解性較低.Rg和Rh的比值為ρ，ρ 值可以用來(lái)描述多糖分子在水溶液中的鏈構(gòu)象，ρ≈0.3 時(shí)，為均一緊密的球形構(gòu)象；ρ≈0.5 時(shí)，為一個(gè)松散連接的超支化鏈或聚合物；ρ≈1.0 時(shí)，為剛性桿狀鏈.分析結(jié)果可知，馬勃狀硬皮馬勃EPS 各精制組分的ρ 值均接近于1，說(shuō)明其EPS 各精制組分在水溶液中可能為剛性桿狀鏈的多糖聚集體.

2.7 馬勃狀硬皮馬勃EPS 的抗氧化活性分析

馬勃狀硬皮馬勃EPS 對(duì)·OH 和·DPPH 自由基的清除率如圖6 所示.從圖6 可以看出，當(dāng)馬勃狀硬皮馬勃EPS 質(zhì)量濃度為10 mg/mL 時(shí)，其對(duì)·OH自由基的清除率高達(dá)22.65%，而當(dāng)馬勃狀硬皮馬勃EPS 濃度為5 mg/mL 時(shí)，其對(duì)·DPPH 自由基的清除率已高達(dá)41.32%.馬勃狀硬皮馬勃EPS對(duì)·DPPH 自由基的清除率明顯高于其對(duì)·OH 自由基的清除率，表現(xiàn)出良好的抗氧化活性.

圖6 馬勃狀硬皮馬勃EPS 對(duì)·OH 和·DPPH自由基的清除率Fig.6 The OH and DPPH radical scavenging rate of EPS from S.areolatum Ehrenb

3 結(jié)論

本研究表明，馬勃狀硬皮馬勃EPS 含有兩個(gè)組分Fr-I 和Fr-II，兩組分的相對(duì)分子質(zhì)量分別為627 500 和4 820.紅外光譜分析可知，其EPS 具有明顯的多糖特征吸收峰，可能為α-吡喃型甘露糖苷酸性雜多糖.Fr-I 和Fr-II 單糖組分和含量分別為：鼠李糖0.86%、1.99%，核糖5.35%、8.36%，木糖9.81%、3.77%，葡萄糖醛酸47.35%、35.05%，半乳糖2.21%、2.82%，葡萄糖4.21%、7.50%，甘露糖29.70%、33.79%，半乳糖醛酸0.51%、6.72%，兩個(gè)組分所含單糖組分的種類一樣，但含量有所差異；兩種組分均含有葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸，表明發(fā)酵所得EPS 可能為酸性多糖，該結(jié)果與紅外光譜分析結(jié)果一致；單糖組分中甘露糖的含量較多，與紅外光譜中810 cm-1處出現(xiàn)的甘露糖特征吸收峰一致.SEC/MALLS 測(cè)定結(jié)果表明，其EPS 分散性很低，在水溶液中很容易形成大量的聚集體，溶解度很小，且在水溶液中以球形構(gòu)象存在，是一種高度緊密而且具有分支結(jié)構(gòu)的多糖聚集體.馬勃狀硬皮馬勃EPS Fr-II 的黏度、相對(duì)分子質(zhì)量和均方旋轉(zhuǎn)半徑均較Fr-I 的小，尤其是均方旋轉(zhuǎn)半徑非常小，說(shuō)明其鏈未舒展開，結(jié)構(gòu)較為致密；馬勃狀硬皮馬勃EPS 的ρ 值接近于1，說(shuō)明其EPS 在水溶液中可能為剛性桿狀鏈的多糖聚集體.馬勃狀硬皮馬勃EPS 質(zhì)量濃度為10 mg/mL 時(shí)，對(duì)·OH 自由基的清除率為22.65%，當(dāng)質(zhì)量濃度為5 mg/mL 時(shí)，對(duì)·DPPH 自由基的清除率高達(dá)41.32%，表現(xiàn)出良好的抗氧化活性.本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究馬勃狀硬皮馬勃EPS 的構(gòu)效關(guān)系及其在醫(yī)藥行業(yè)的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ).

［1］Chihara G，Maeda Y，Hamuro J，et al.Inhibition of mouse sarcoma 180 by polysaccharides from Lentinus edodes（Berk.）Sing［J］.Nature，1969，222：687-688.

［2］Reshetnikov S，Wasser S，Tan K.Higher basidiomycota as a source of antitumour and immunostimulating polysaccharides［J］.International Journal of Medicinal Mushrooms，2001，3：361-394.

［3］Cui J，Chisti Y Y.Polysaccharopeptides of coriolus versicolor:physiological activity，uses，and production［J］.Biotechnol Advances，2003，21：109-122.

［4］徐麗萍.真菌多糖的生物活性及分離純化技術(shù)研究進(jìn)展［J］.生物學(xué)教學(xué)，2014，39（12）：3-5.

［5］劉波.中國(guó)藥用真菌［M］.太原：山西人民出版社，1978：272.

［6］卯曉嵐.中國(guó)經(jīng)濟(jì)真菌［M］.北京：科學(xué)出版社，1998：613.

［7］Monika W，Alberto G，Helga S，et al.Unusual pulvinic acid dimers from the common fungi Scleroderma citrinum and Chalciporus piperatus［J］.Angewandte Chemie International Edition，2004，43（14）:1883-1886.

［8］Somde J K，Kwanjai K，Thirada P，et al.A bioactive triterpenoid and vulpinic acid derivatives from the mushroom Scleroderma citrinum［J］.Planta Medica，2003，69（6）:568-571.

［9］柯軼，巫文政，毛寧.一株蟲草類真菌的液體發(fā)酵產(chǎn)胞內(nèi)多糖培養(yǎng)基的優(yōu)化［J］.海峽科學(xué)，2010（7）:3-5.

［10］Sevag M G.Mechanism of the respiration of pneumococci.II［J］.Biochemical Pharmacology，1934，273:419-429.

［11］Dubois M，Gilles K A，Hamilton J K.Colorimetric method for determination of sugars and related substances［J］.Analytical Chemistry，1956，28（3）:350-356.

［12］陳永，盧戌，譚曉晶，等.紅毛五加多糖的分離純化與分子質(zhì)量測(cè)定［J］.四川大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2005，42（2）:373-376.

［13］Kasperdl W，Tzianabos A.Biological chem istry of immunomodulation by zwitteronic polysaccharides［J］.Carbohydrate Research，2003，338:2531-2542.

［14］林勤保，蔣梅峰，楊春.氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定大棗低聚糖的單糖組成［J］.食品科學(xué)，2009，30（19）:210-212.

［15］Li Y，Weiss W F，Roberts C J.Characterization of high-molecular-weight nonnative aggregates and aggregation kinetics by size exclusion chromatography with inline multi -angle laser light scattering［J］.Journal of Pharmaceutical Sciences，2009，98:3997-4016.

［16］Jumel K，F(xiàn)iebrig I，Harding S E.Harding rapid size distribution and purity analysis of gastric mucus glycoproteins by size exclusion chrom -atography/multi-angle laser light scattering［J］.International Journal of Biological Macromole -cules，1996，18:133-139.

［17］石磊，韓龍，劉超.多糖的構(gòu)象研究方法綜述［J］.曲阜師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，38（3）:78-84.

［18］邵麗，吳正鈞，吳江，等.鼠李糖乳桿菌胞外多糖S1 的分子特性研究［J］.食品工業(yè)科技，2014，11（21）：1-11.

［19］許淑琴.黑木耳剛性鏈葡聚糖結(jié)構(gòu)、鏈構(gòu)象轉(zhuǎn)變及自組裝行為［D］.武漢：武漢大學(xué)，2013.

［20］Debye P，Bueche A M.Intrinsic viscosity，diffusion，and sedimentation rate of polymers in solution［J］.The Journal of Chemical Physics，1948，16（6）:573-579.

［21］郭甜甜，于桂洪，郭濤，等.紅樹林根泥真菌Aspergillus versicolor sp.PJX-9 胞外多糖結(jié)構(gòu)特征及抗氧化活性研究［J］.中國(guó)海洋藥物，2015，34（2）：29-33.

［22］聶少平，謝明勇，羅珍.用清除有機(jī)自由基DPPH 法評(píng)價(jià)茶葉多糖的抗氧化活性［J］.食品科學(xué)，2006，27（3）：34-36.

［23］武翠玲，鄧永康，孟延發(fā).大馬勃水溶性多糖的結(jié)構(gòu)研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2008，20（6）:1027-1030.

［24］Volpi N.Milligram-scale preparation and purification of oligosaccharides of defined length possessing the structure of chondroitin from defructosylated capsular polysaccharide K4［J］.Glycobiology，2003，13（9）:635-640.

［25］唐雨薇，張宇，王宇亮，等.黃芪多糖分離與結(jié)構(gòu)特征分析［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2014，25（5）:1097-1100.

［26］馬素云，姚麗芬，葉長(zhǎng)文，等.1 種銀耳多糖的分離純化及結(jié)構(gòu)分析［J］.中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2013，13（1）:173-177.

［27］Huang Z P，Huang Y N，Li X B，et al.Molecular mass and chain conformations of Rhizoma panacis Japonici polysaccharides［J］.Carbohydrate Polymers，2009，78（3）:596-601.