王云龍，胡俊峰，李玉林，王繼創(chuàng)，程 蕾

（1.河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.河南省生物工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450001）

0 前言

降鈣素原（PCT）編碼基因定位于人類第11 號染色體，該基因由6 個外顯子和5 個內(nèi)含子組成，總長約7 600 bp，其中編碼區(qū)長度為2 800 bp.基因轉(zhuǎn)錄后在甲狀腺濾泡旁細胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)翻譯成降鈣素原前體，進而在內(nèi)源多肽酶的作用下修飾加工，生成116 個氨基酸的終產(chǎn)物PCT[1].PCT可由細胞內(nèi)特殊蛋白酶分解生成降鈣素，這種肽類激素對人體有重要的調(diào)節(jié)作用.正常情況下，PCT 在血清中的含量非常低，僅為10～50 pg/mL，然而在系統(tǒng)炎癥反應(yīng)綜合癥、敗血癥、急慢性肺炎、急性胰腺炎等細菌性感染的患者血清中PCT水平顯著升高，其濃度可達正常水平的幾千倍甚至上萬倍，而在局部感染、病毒感染、慢性非特異性炎癥等患者的血清中PCT 濃度不增加或輕微增加，這就決定了PCT 相較于其他血清標志物而言具有高度的特異性[2]，可作為細菌感染的特異性指標，用于細菌類疾病的鑒別診斷[3]，為醫(yī)生是否使用抗生素提供有價值的參考.不僅如此，由于PCT的濃度和疾病的嚴重程度呈正相關(guān)，并隨著病情的發(fā)展變化而變化，因此PCT 又可作為判斷病情與愈后以及療效觀察的可靠指標[4]，醫(yī)生可以通過監(jiān)測PCT 的變化從而觀察抗生素的治療效果，使患者及時得到針對性治療，縮短治療周期、減少治療費用[5]，因此早期PCT 的定量檢測臨床意義重大，也正是開展本研究的目的所在.與其他PCT 檢測方法相比，ELISA 酶免檢測方法具有較高的敏感性和特異性、成本低、檢測時間短、無污染[6]，可在大多數(shù)基層醫(yī)院使用[7].因此本研究制備了PCT 高特異性的單克隆抗體并且建立了PCT 的雙抗體夾心ELISA 定量檢測方法.

1 材料和方法

1.1 材料

PCT 抗原以及PCT 酶標抗體由河南省生物技術(shù)研究中心提供；47 份細菌感染血清標本、38 份健康人血清標本、50 份PCT 臨床陽性血清標本由鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院鑒定（羅氏電化學(xué)發(fā)光法）并提供；PCT 線性參考品（P1=10 ng/mL、P2=5 ng/mL、P3=2 ng/mL、P4=1 ng/mL、P5=0.5 ng/mL）.精密性質(zhì)控品為6 ng/mL 均由河南省生物工程技術(shù)研究中心提供，所有標本無溶血、常規(guī)傳染?。℉N、HCV、HBV）檢測陰性；其他常規(guī)化學(xué)試劑均為分析純.

1.2 方法

1.2.1 PCT 單克隆抗體的制備

選取6～8 周齡，體質(zhì)量17～21 g 的Balb/c 小鼠，每只小鼠分別經(jīng)皮下多點注射PCT 抗原混合等體積的弗氏完全佐劑.首次免疫4 周后進行第二次免疫，加等體積的弗氏不完全佐劑，7 d 后再加強免疫一次.然后取免疫小鼠的脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞株sp2/0 細胞按常規(guī)方法融合，經(jīng)間接ELISA 篩選，有限稀釋法獲得單克隆化細胞株后，按常規(guī)方法制備腹水從而制備大量的PCT 單克隆抗體[8].

1.2.2 PCT 單克隆抗體的特性鑒定

使用Western-blot 法，取PCT 抗原進行SDSPAGE，并轉(zhuǎn)至PVDF 膜，封閉，依次滴加雜交瘤細胞的培養(yǎng)上清及HRP 標記的羊抗鼠IgG，顯色后觀察是否有特異性條帶.

1.2.3 PCT 雙抗體夾心ELISA 定量檢測方法的建立

1.2.3.1 包被液的選擇及條件優(yōu)化

根據(jù)本實驗室經(jīng)驗選用常用的0.01 mol/L PB（pH7.2）、0.05 mol/L CB（pH9.6）兩種包被緩沖液，分別在37 ℃和4 ℃通過不同時間包被來進行包被條件的優(yōu)化試驗，并得出最佳包被條件.

1.2.3.2 封閉液的選擇及條件優(yōu)化

封閉液的選擇：選用常用的0.3%BSA、0.6%BSA、1%BSA 3 種不同濃度進行對比；封閉時間及溫度的選擇：37 ℃下1、2、4 h；4 ℃下12、18、24 h.同樣用已知的線性參考品進行封閉條件試驗比較，得出最佳封閉條件.

1.2.3.3 包被抗體和酶標抗體最佳工作濃度的確定

包被抗體濃度選擇：300、400、500 ng/mL.酶標抗體濃度選擇：1∶4 000、1∶6 000、1∶8 000、1∶10 000.分別用線性參考品進行棋盤滴定檢測.

1.2.3.4 反應(yīng)模式和反應(yīng)時間的確定

選用兩步法模式，在兩步法中選擇模式一（30 min+30 min+20 min）、模式二（60 min+30 min+20 min）、模式三（60 min+60 min+20 min）3 種方式進行試驗.用已知線性參考品進行檢測，根據(jù)結(jié)果分析確定最佳反應(yīng)模式.

1.2.3.5 線性考察

通過已建立的PCT 檢測方法對線性參考品進行檢測.以O(shè)D 值為縱坐標y，參考品濃度為橫坐標x，建立標準曲線.

1.2.4 臨床樣品考核

1.2.4.1 靈敏度和特異性的試驗

用已建立的方法來檢測136 份細菌性感染病人血清和90 份病毒性感染病人血清，通過結(jié)果來考察本方法的靈敏度和特異性.

1.2.4.2 臨床標本對比檢測試驗

羅氏PCT 試劑盒作為本檢測方法的參照試劑盒，用建立的ELISA 雙抗體夾心檢測方法與羅氏PCT 試劑盒對比檢測50 份PCT 定值血清標本，評價制備的PCT 雙抗體夾心ELISA 檢測方法.

2 結(jié)果與討論

2.1 PCT 單克隆抗體的制備和鑒定

經(jīng)細胞融合、篩選及克隆化，獲得8 株能穩(wěn)定分泌抗PCT mAb 的雜交瘤細胞株，Westem-blot 顯示，所有雜交瘤細胞株的培養(yǎng)上清能同時檢測到PCT 抗體，表明這8 株單克隆抗體可特異地識別PCT.

2.2 包被液的選擇及條件優(yōu)化

表1 顯示：當包被液選擇用0.05 mol/L pH 9.6 的CB 緩沖液時其R2值及P5 檢測值均高于0.01 mol/L 的pH7.2 的PB 緩沖液.而且包被的溫度和時間設(shè)定為4 ℃下包被12 h 要優(yōu)于37 ℃下包被4 h.因此最終確定0.05 mol/L，pH9.6 的CB緩沖液在4 ℃條件下包被12 h 最有利于PCT 的檢測.

表1 不同包被條件下血清樣品檢測結(jié)果Table 1 Detection results of serum samples coated under different conditions

包被液的pH、離子強度、包被反應(yīng)時間及包被環(huán)境溫度的不同會影響固相載體對蛋白的吸附能力.由表1 可以看出，包被緩沖液偏堿性有利于該抗體與包被板的吸附.包被時間過短不利于包被抗體的吸附.包被溫度選擇上，低溫和高溫的結(jié)果雖然相近，但是高溫可能會對包被抗體的活性造成的影響是試驗中必須考慮的因素.從生產(chǎn)工藝上考慮，4 ℃包被12 h，包被間隔期可以選擇晚上，不會影響生產(chǎn)進度，所以選擇低溫包被12 h.

2.3 封閉液的選擇及條件優(yōu)化

由表2 可以看出，用0.6% BSA 在37 ℃下封閉2 h 其R2值（0.996 8）及P5 檢測值（0.123）符合要求，能夠有效封閉包被板中未被目標抗體結(jié)合的蛋白位點，避免假陽性現(xiàn)象的出現(xiàn).因此研究選擇封閉條件為0.6% BSA 在37 ℃下封閉2 h.

表2 不同封閉條件下血清樣品檢測結(jié)果Table 2 Detection results of serum samples closured under different conditions

根據(jù)表2 選擇了37 ℃下封閉2 h，原因一：37℃下的R2和P5 值都較好，符合試驗要求.原因二：時間上可以大幅減少，試驗進度不會拉長.原因三：封閉完成之后緊接著就進行下一步的試驗或者存冷庫保存，抗體活性與4 ℃下相比幾乎沒有區(qū)別.

2.4 最佳抗體包被濃度和酶標濃度的確定

表3 結(jié)果顯示：400 ng/mL 的抗體包被濃度與1∶8 000 酶標二抗?jié)舛扰鋵πЧ詈?，其檢測結(jié)果P5=0.148，R2=0.993 5，滿足試驗要求.因此選擇最佳的包被抗體濃度為400 ng/mL，最佳酶標抗體濃度為1∶8 000.

表3 不同樣品稀釋度條件下血清樣品檢測結(jié)果Table 3 Detection results of serum samples diluted under different conditions

2.5 反應(yīng)模式和反應(yīng)時間的確定

由表4 可知，兩步法線性關(guān)系良好，模式一的反應(yīng)模式線性范圍更寬，R2＞0.98，符合研究要求，并在總體上檢測時間比其他模式所需要的時間更少.因此，綜合判斷結(jié)果，將模式一作為本研究的檢測模式.

表4 不同反應(yīng)模式下血清樣品的檢測結(jié)果Table 4 Detection results of serum samples under different response modes

由表4 可知，雖然模式二和模式三的線性也符合試驗要求，但是在確保標準品P5 檢出值符合要求的前提下，綜合3 種模式的檢測線性范圍，模式一的線性范圍更寬，而且模式一在整體檢測時間上得以縮短，只需要90 min，提高了檢測的效率，因此選擇模式一.

2.6 線性考察結(jié)果

通過建立起的線性參考品繪制曲線（圖1）可見，PCT 濃度在0.5～10 ng/mL 范圍中呈線性關(guān)系，R2≥0.98 符合試驗要求.

圖1 PCT 線性曲線Fig.1 PCT linear diagram

2.7 臨床靈敏度和臨床特異性

使用本研究中建立的PCT 雙抗體夾心ELISA定量檢測方法檢測136 例臨床確診為細菌感染性疾病的患者，136 例檢測結(jié)果PCT 大于2 ng/mL，靈敏度達到95.6%，另外檢測90 例病毒感染血清，88例呈陰性，特異性為97.8%，結(jié)果見表5.

由表5 可以看出，在陽性臨床血清檢測中本PCT 酶免檢測方法的靈敏度達到95.6%，在陰性臨床血清檢測中特異性達到了97.8%，因而本試驗建立的方法在臨床檢測中具有較高的敏感性和特異性.

2.8 臨床標本對比檢測試驗

與羅氏試劑盒對比，驗證本研究中建立的PCT雙抗體夾心ELISA 定量檢測方法的檢測效果.將大于10 ng/mL 含量的血清按一定比例倍比稀釋后分別用這兩種方法進行檢測.

表5 PCT 定量檢測方法的靈敏度和特異性分析Table 5 The sensitivity and specificity of the quantitative method of PCT

圖2 相關(guān)性對比檢測曲線Fig.2 Linear diagram of the correlation results

圖2 結(jié)果顯示，R2值為0.967 0，二者相關(guān)性良好，本試驗建立的PCT 雙抗體夾心ELISA 定量檢測方法達到了較高的水平.

臨床上抗生素的合理應(yīng)用是人們十分關(guān)注的問題.抗生素的濫用不僅對病情治療毫無幫助，反而會延誤病情，對人體產(chǎn)生毒副作用，增加細菌耐藥性，加重病情甚至造成二重感染[9]，而多數(shù)醫(yī)生在抗生素應(yīng)用上依靠自身經(jīng)驗[10]，因缺乏客觀指標往往很難把握.PCT 作為細菌感染的特異性指標[11]，不僅可以作為是否使用抗生素的參考指標和依據(jù)，還可以通過監(jiān)測病人PCT 的變化從而觀察抗生素的治療成效，給抗生素的應(yīng)用提供科學(xué)指導(dǎo)[12].因此，建立靈敏特異，可靠性強的PCT 血清學(xué)定量檢測方法尤其重要.

本試驗室通過酶聯(lián)免疫技術(shù)建立了PCT 定量檢測方法.與PCT 膠體金檢測技術(shù)相比，克服了膠體金技術(shù)不能定量檢測血液中PCT 含量的缺點，PCT 酶免檢測技術(shù)能夠準確地檢測血液中PCT 含量，并能夠監(jiān)測PCT 含量的變化情況，給臨床診斷提供可靠的依據(jù).與PCT 化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)相比，PCT 酶免檢測方法成本低，對檢測人員技術(shù)要求不高，能夠滿足大多數(shù)基層醫(yī)院的需求.

3 結(jié)論

本研究制備了PCT 特異性的單克隆抗體進而建立了基于ELISA 的PCT 定量檢測方法.經(jīng)試驗確定的反應(yīng)條件和參數(shù)為：包被液選擇4 ℃下pH 9.6 的0.05 mol/L CB 包被12 h，封閉液選擇37 ℃下0.6%BSA 封閉2 h，包被濃度為400 ng/mL，酶標濃度為1∶8 000，所能定量的線性范圍為0.5～10 ng/mL，靈敏度95.6%，特異性97.8%.該方法與羅氏試劑盒對比檢測的結(jié)果顯示兩者相關(guān)性R2=0.967 0.所以本研究建立的PCT 雙抗體夾心ELISA 定量檢測方法靈敏度高，特異性強，具有潛在的商業(yè)應(yīng)用價值.

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