馬莉岷，戰(zhàn)偉超，于 江，林 劍，徐世艾*

（1.煙臺大學 化工制造省級重點實驗室，山東 煙臺 264005；2.山東魯花生物科技有限公司，山東 煙臺 264005）

琥珀酸鈉具有明顯的海鮮貝類滋味，廣泛用于方便面海鮮湯料、肉制品、醬油、海鮮類產(chǎn)品等食品及其加工領域[1]。琥珀酸鈉作為調(diào)味品其主要特征：具有貝類風味，是提高食品美味的一種新型呈味物質(zhì)；可與其他調(diào)味品以一定的比例混合使用可起到協(xié)同增效的作用；琥珀酸鈉在調(diào)味的同時，還能緩和其他調(diào)味品的刺激（如鹽味）；由于琥珀酸鈉具有良好的熱穩(wěn)定性，故可廣泛的使用在需要熱處理的食品加工中；琥珀酸鈉滲透性強，增強了其調(diào)味效果，同時它又是不揮發(fā)性有機酸，具有一定的防腐作用。綜上所述，琥珀酸鈉作為新型的增鮮劑將具有良好的發(fā)展趨勢[2]。

用于醬油生產(chǎn)的AS3.024或其誘變菌株在發(fā)酵過程中只能產(chǎn)生微量的琥珀酸。而目前發(fā)酵法生產(chǎn)食用級琥珀酸還未實現(xiàn)規(guī)模化和產(chǎn)業(yè)化，生產(chǎn)成本限制了其在醬油中的使用，最重要的是直接在醬油中添加琥珀酸也難以被消費者接受[3-5]。因此，本研究致力于在發(fā)酵過程中提高醬油中琥珀酸的含量，增加其鮮味。

近年來，國內(nèi)外相關研究主要集中于琥珀酸菌種的選育和發(fā)酵培養(yǎng)條件優(yōu)化等方面[6-7]。相比于菌種的誘變選育和丁二酸的分離純化所做的工作，有關于琥珀酸產(chǎn)生菌在多菌種釀造醬油中的應用研究鮮見報道[8-9]，針對丁二酸固體發(fā)酵動力學的研究也很少，劉曉艷等[10-11]從釀酒大曲中成功分離篩選出一株琥珀酸產(chǎn)生菌，該菌具有淀粉、蛋白水解能力，系一株真菌門（Fungi）、藻菌綱（Phycomycetes）、毛霉目（Mucorales）、毛霉科（Mucoraceae）、毛霉屬（Mucor）、總狀枝毛霉組（Racemousus）中的總狀枝毛霉（M.racemosusFresenius），將其命名為SH-20。SH-20固體制曲所得成曲按照一定比例與AS3.024成曲混合后，采用高鹽稀態(tài)釀造工藝，得到的成品中琥珀酸含量明顯提高，含量達0.48 g/100 mL。為了進一步探究其最適發(fā)酵條件，最終實現(xiàn)工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。因此，在對琥珀酸產(chǎn)生菌SH-20發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件研究的基礎上，對該菌株的固體發(fā)酵動力學進行了初步研究，建立了琥珀酸產(chǎn)生菌SH-20菌體生長、產(chǎn)物形成和底物消耗動力學模型。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

琥珀酸產(chǎn)生菌SH-20：煙臺大學生物工程實驗室保藏。

斜面培養(yǎng)基采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、瓊脂15～20 g、葡萄糖20 g，水1 000 mL，pH自然。

固體制曲培養(yǎng)基：豆粕12 g，潤水20 min后蒸料，再加入小麥粉8 g，滅菌20 min，pH自然。

1.2 儀器與設備

LRH-250生化培養(yǎng)箱、PHG-9245A電熱恒溫干燥箱：上海一恒科技有限公司；7200紫外可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；2487高效液相色譜儀：美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

菌懸液的制備：刮取斜面培養(yǎng)基中的孢子于生理鹽水中，振蕩5 min，用血球計數(shù)板測定孢子濃度。

培養(yǎng)基的制備：按1.1方法配制培養(yǎng)基。

發(fā)酵：待培養(yǎng)基冷卻后吸取菌懸液接種于培養(yǎng)基中，使含水量為62%的固體培養(yǎng)基中接種量為4.4×105個/g，30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。

1.3.2 分析方法

（1）底物干質(zhì)量的測定

取不同發(fā)酵時間的培養(yǎng)物，將固體曲于60 ℃烘干至恒質(zhì)量，底物干質(zhì)量計算公式如下：

（2）菌體量的測定

采用核酸測定法[12-13]。

（3）琥珀酸含量的測定

樣品處理：稱取5 g烘干后的固體曲、粉碎、60 ℃浸提4 h、5 000 r/min離心20 min，取上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾由HPLC測定琥珀酸含量。

色譜條件：色譜柱為YMC-pack ODS-A（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為V（甲醇）∶V（0.02 mol/L KH2PO4）=7∶93，pH 2.5流動相流速0.5 mL/min，進樣量為20 μL，檢測波長214 nm。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理方法

應用Origin8.0軟件處理實驗數(shù)據(jù)和模型，擬合出所有模型參數(shù)，建立發(fā)酵動力學數(shù)學模型。

2 結果與分析

2.1 琥珀酸產(chǎn)生菌固態(tài)發(fā)酵過程中主要參數(shù)的變化情況

對琥珀酸產(chǎn)生菌固體發(fā)酵產(chǎn)丁二酸過程中主要參數(shù)底物消耗、菌體生長和琥珀酸合成的變化情況進行了測定，結果見圖1。從圖1可以看出，發(fā)酵過程中，琥珀酸的合成與菌體生長同步，增長趨勢基本一致。而底物消耗呈先快后緩的趨勢。在經(jīng)過很短的延遲期后，菌體進入對數(shù)生長期，同時伴隨琥珀酸的生成，底物消耗用于菌體生長和琥珀酸產(chǎn)生。到72 h左右，進入生長穩(wěn)定期，底物消耗減緩，產(chǎn)物濃度變化也小，發(fā)酵周期可控制在72 h左右。

圖1 琥珀酸產(chǎn)生菌固體發(fā)酵過程Fig.1 Solid-state fermentation process of succinic acid producing strain

2.2 固態(tài)發(fā)酵動力學模型的建立

2.2.1 菌體生長動力學模型

Monod模型作為描述菌體生長最簡單且有效的模型，是典型的決定論均相非結構模型。此方程基于單一生長限制性底物，其他營養(yǎng)成分不影響微生物生長；假設菌體得率為常數(shù)，且沒有動態(tài)滯后的情況，這兩種假設不符合琥珀酸發(fā)酵的特征，采用Monod方程有偏差[14]。

而Verhulst-Pearl提出的Logistic方程是一個典型的S型曲線，能反映菌體濃度增加對自身生長的抑制作用，能較好的擬合發(fā)酵過程的菌體生長規(guī)律[15]。

菌體生長可用Logistic模型來描述，即：

式中：X為菌體濃度，mg/g；μmax為最大比生長速率，h-1；Xmax為最大菌體濃度，mg/g。

2.2.2 產(chǎn)物形成動力學模型

微生物的產(chǎn)物形成過程非常復雜，GADEN E L[16]將產(chǎn)物合成與菌體生長及底物消耗相關聯(lián)，定性的將發(fā)酵過程分為3種類型：①生長偶聯(lián)型：只是在菌體生長時才有產(chǎn)物生成；②部分偶聯(lián)型：在菌體生長時有部分產(chǎn)物形成，大部分產(chǎn)物是在菌體處于生長穩(wěn)定期形成的；③非偶聯(lián)型：細胞存在，產(chǎn)物就會生成。Luedeking-Piret方程對一般發(fā)酵過程原則上都適用。因此選用式（2）描述產(chǎn)物琥珀酸的動力學模型。

式中：α為產(chǎn)物合成系數(shù)；β為非生長偶聯(lián)系數(shù)；p為琥珀酸含量，mg/g。

2.2.3 底物消耗動力學

底物的消耗用以菌體維持、菌體生長和產(chǎn)物消耗，常用的底物消耗動力學模型基于底物消耗的物料恒算建立的方程式，常用模型為：

式中：S為底物減質(zhì)量，%；Ke為維持系數(shù)；yX/S為菌體得率系數(shù)。

2.3 動力學模型的求解和擬合

2.3.1 菌體生長動力學模型的求解

對式（1）進行積分可得：

用Origin8.0軟件按上式（4）進行非線性曲線擬合，得到菌體濃度X隨時間變化的函數(shù)為：

根據(jù)式（5）可計算出不同時間的菌體濃度，該方程與發(fā)酵過程中的實驗數(shù)據(jù)較好的擬合，其平均擬合誤差為0.44%，由圖2可以看出，計算值與實驗值基本吻合?？捎嬎愠銎渥畲缶w濃度Xmax=33.382 mg/g，菌體的初始濃度X0=1.695 mg/g，最大比生長速率μmax=0.067 h-1。

圖2 SH-20發(fā)酵過程中菌體濃度隨時間變化曲線Fig.2 Changing curves of bacteria concentration during strain SH-20 fermentation

2.3.2 產(chǎn)物生產(chǎn)動力學模型的求解

將式（1）帶入式（2）并積分：

將μmax=0.067，X0=1.695 mg/g，Xmax=33.382 mg/g 代入產(chǎn)物生成動力學模型，整理成：

通過Origin8.0軟件對發(fā)酵過程中琥珀酸合成的實驗數(shù)據(jù)進行處理，可求得α=1.736，β=-0.001 1，因此琥珀酸合成動力學表達式為：

該方程與實驗所得數(shù)據(jù)能較好地擬合，結果如圖3所示。

圖3 SH-20發(fā)酵過程中琥珀酸含量隨時間變化曲線Fig.3 Changing curves of succinate concentration during strain SH-20 fermentation

2.3.3 底物消耗動力學模型的求解

為簡化模型，菌體呼吸等維持代謝消耗歸結在長菌消耗之內(nèi)。琥珀酸產(chǎn)生菌的基質(zhì)消耗大體可分為長菌消耗和生成琥珀酸產(chǎn)物消耗兩部分。底物消耗的動力學模型簡化為：

其中yX/S為細胞收率系數(shù)；yp/S為纖維素產(chǎn)率系數(shù)，令1/yX/S=A，令1/yp/S=B。

將式（1）和式（2）帶入式（9）積分得：

通過Origin8.0軟件對其進行非線性回歸擬合得到：1/yX/S=-0.002 6，1/yp/S=-0.389 6。

因此底物消耗動力學方程為：

該方程與實驗所得數(shù)據(jù)能較好地擬合，結果如圖4所示。

圖4 SH-20發(fā)酵過程中底物隨時間變化曲線Fig.4 Changing curves of substrate consumption during strain SH-20 fermentation

3 結論

采用Logisstic方程、Luedeking-Piret方程和類似Luedeking-Piret方程，結合琥珀酸產(chǎn)生菌SH-20發(fā)酵特征分析，建立了SH-20固體發(fā)酵過程中菌體生長、產(chǎn)物合成以及底物消耗隨時間變化的發(fā)酵動力學模型，將模型預測值與實驗值進行比較，結果表明所建立的模型能就較好預測實際發(fā)酵過程，對于優(yōu)化發(fā)酵工藝，進一步放大具有重要的指導作用。

[1]王金主，袁建國，王元秀，等.發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酸的研究進展[J].食品與藥品，2010，12（1）：55-59.

[2]張小葉.大腸桿菌木糖生物合成琥珀酸的代謝工程研究[D].長春：吉林大學碩士論文，2013.

[3]FENG J,ZHAN X B,ZHENG Z Y,et al.New model for flavour quality evaluation of soy sauce[J].Czech J Food Sci,2013,31(3):292-305.

[4]ZEIKUS J,JAIN M,ELANKOVAN P.Biotechnology of succinic acid production and markets for derived industrial products[J].Appl Microbiol Biot,1999,51(5):545-552.

[5]BECHTHOLD I,BRETZ K,KABASCI S,et al.Succinic acid:a new platform chemical for biobased polymers from renewable resources[J].Chem Eng Technol,2008,31(5):647-654.

[6]LEE P,LEE S,HONG S,et al.Isolation and characterization of a new succinic acid-producing bacterium,Mannheimia succiniciproducensMBEL55E,from bovine rumen[J].Appl Microbiol Biot,2002,58(5):663-668.

[7]LEE P C,LEE S Y,CHANG H N.Succinic acid production byAnaerobiospirillum succiniciproducensATCC 29305 growing on galactose,galactose/glucose,and galactose/lactose[J].J Microbiol Biotechnol,2008,18(11):1792-1796.

[8]李會品.啤酒抗氧化力評價及其與老化物質(zhì)關系的研究[D].廣州：華南理工大學碩士論文，2013.

[9]邱立友，宮名宇，朱光州.多菌種在醬油釀造中的應用[J].中國釀造，1993，12（1）：2-7.

[10]劉曉艷，林 劍，徐世艾.琥珀酸產(chǎn)生菌原生質(zhì)體的復合誘變[J].食品科技，2009（3）：6-10.

[11]孫 瑩，林 劍，劉曉艷，等.琥珀酸產(chǎn)生菌SH-24 菌株的初步鑒定[J].食品與生物技術學報，2007，26（5）：88-91.

[12]魏培蓮，岑沛霖，盛春琦.3 種固態(tài)發(fā)酵生物量測定方法的比較[J].食品與生物技術學報，2006，25（1）：60-64.

[13]徐志南，陳秀奇，陳新愛，等.重組枯草芽孢桿菌生產(chǎn)青霉素G ?；赴l(fā)酵條件的研究[J].高校化學工程學報，2003，17（3）：266-271.

[14]LEVENSPIEL O.The Monod equation:a revisit and a generalization to product inhibition situations[J].Biotechnol Bioeng,1980,22(8):1671-1687.

[15]TRULLA L,GIULIANI A,ZBILUT J,et al.Recurrence quantification analysis of the logistic equation with transients[J].Phys Lett A,1996,223(4):255-260.

[16]GADEN E L.Fermentation process kinetics[J].Biotechnol Bioeng,2000,67(6):413-429.