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        殼聚糖鹽酸鹽對幾種水產(chǎn)致病菌的抑菌性研究

        2015-04-23 08:58:52孫玉英張繼泉
        中國釀造 2015年1期
        關(guān)鍵詞:鹽酸鹽濾紙弧菌

        孫玉英,張繼泉*

        (1.江蘇省海洋資源開發(fā)研究院,淮海工學(xué)院,江蘇 連云港 222005;2.中國科學(xué)院 海洋研究所 實(shí)驗(yàn)海洋生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266071)

        目前,對蝦疾病仍然是困擾對蝦養(yǎng)殖業(yè)的一大難題,由弧菌屬(Vibrio)細(xì)菌引起的弧菌病是其中危害最大的細(xì)菌性疾病,給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-5]。由于弧菌是海洋環(huán)境中最常見的細(xì)菌類群之一,廣范分布于河口海區(qū)以及海洋生物體中,同時弧菌是一類條件致病菌,當(dāng)水體環(huán)境變化,弧菌尤其是致病性弧菌繁殖迅速,如數(shù)量超過閾值則容易引發(fā)對蝦弧菌病。對蝦病的防治主要是通過添加化學(xué)物質(zhì)、細(xì)菌組分、多糖、動植物提取物、營養(yǎng)因子以及細(xì)胞分裂素等免疫增強(qiáng)劑等增強(qiáng)對蝦的免疫力[6]。

        殼聚糖是天然多糖中唯一的堿性多糖,殼聚糖作為抑菌劑具有毒性低、使用安全等優(yōu)點(diǎn)[7-8]。目前殼聚糖作為抗菌劑得到了廣泛的應(yīng)用,但殼聚糖較低的溶解性使其應(yīng)用受到限制,對其進(jìn)行化學(xué)改性后的水溶性衍生物可使其應(yīng)用領(lǐng)域得到進(jìn)一步的拓展[9]。其中殼聚糖鹽酸鹽是將殼聚糖簡單改性后的一種水溶性產(chǎn)物。由于殼聚糖鹽酸鹽保持了殼聚糖的品質(zhì),具有良好的成膜性和抑菌性,被用于食品、果蔬等的添加劑和保鮮劑。但殼聚糖鹽酸鹽被用于水產(chǎn)病害防治尚少見報道。本試驗(yàn)研究殼聚糖鹽酸鹽對幾種水產(chǎn)致病弧菌的抑菌效應(yīng),從而探討殼聚糖鹽酸鹽用于防治對蝦弧菌病的可行性,旨在為對蝦弧菌病的防治提供基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        1.1.1 菌株

        鰻弧菌(Vibrio anguillarum)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)由淮海工學(xué)院海洋學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提供。

        1.1.2 培養(yǎng)基

        菌體的保存和培養(yǎng)均采用LB培養(yǎng)基:蛋白胨10 g/L,酵母提取物5 g/L,NaCl 10 g/L,蒸餾水1 000 mL,pH 7.0。

        固體LB培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加2%瓊脂。

        1.1.3 藥品

        殼聚糖鹽酸鹽:浙江金殼藥業(yè)有限公司,脫乙酰度為80.0%~90.0%,黏度為10~120 MPa·s。

        1.2 儀器與設(shè)備

        BS323S電子天平:賽多制斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;spx-250B-Z生化培養(yǎng)箱:上海博迅實(shí)業(yè)醫(yī)療器械有限公司;HYG全溫振蕩培養(yǎng)箱:上海欣蕊自動化設(shè)備有限公司;LDZM-80KCS立式壓力蒸汽滅菌器:上海申安醫(yī)療器械廠;HD920新型潔凈工作臺:北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司:Infinite 200 PRO NanoQuant酶標(biāo)儀:瑞士TECAN公司。

        1.3 方法

        1.3.1 菌懸液制備

        將菌種采用平板劃線法接種在平板上培養(yǎng)1 d,挑取單菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。液體培養(yǎng)基稀釋為107~108CFU/mL。

        1.3.2 抑菌圈的測定[10]

        用打孔器在濾紙上打出直徑6 mm的濾紙片,置于培養(yǎng)皿中高壓蒸汽滅菌(121 ℃滅菌20 min)后,備用。實(shí)驗(yàn)組浸泡在殼聚糖鹽酸鹽溶液中,對照組浸泡在無菌水中。

        按照無菌操作的要求向無菌培養(yǎng)皿中倒入適量LB培養(yǎng)基,每個培養(yǎng)皿中約10 mL,即培養(yǎng)基的厚度均約為3.6 mm。培養(yǎng)基凝固后,用移液器吸取0.1 mL菌懸液于培養(yǎng)基表面,用涂布棒涂布均勻,然后用鑷子取出100 mg/mL溶液中浸泡2 h的濾紙片,將濾紙片輕輕放入培養(yǎng)基表面,每個培養(yǎng)皿等距離放三個濾紙片,用無菌水做空白對照,置于培養(yǎng)皿正中央。放入培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)(培養(yǎng)溫度30 ℃,培養(yǎng)時間24 h)。取出后觀察并用游標(biāo)卡尺測出濾紙片抑菌圈直徑大小,比較抑菌效果。

        1.3.3 最小抑菌濃度測定

        每種供試菌均設(shè)陽性對照(6個孔只加菌液),陰性對照(6個孔只加無菌培養(yǎng)基)。副溶血弧菌的殼聚糖鹽酸鹽溶液質(zhì)量濃度為40 mg/mL,哈維氏弧菌和鰻弧菌的殼聚糖鹽酸鹽溶液質(zhì)量濃度為60 mg/mL。在實(shí)驗(yàn)組的每一個孔中各加入100 μL菌液,取相應(yīng)質(zhì)量濃度的供試藥液100 μL加入到實(shí)驗(yàn)組的第一個孔中,混勻后,吸取100 μL混合液加入到第二個實(shí)驗(yàn)孔,依次稀釋下去,直到第十二個孔混勻后吸取100 μL混合液棄去,每種供試菌的實(shí)驗(yàn)組均設(shè)三組平行實(shí)驗(yàn)共三行(每行12個孔)。用酶標(biāo)儀在600 nm波長處測定其吸光度值,測定結(jié)束后將96孔板包好放在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2 h測一次。以時間為橫坐標(biāo),OD600nm值為縱坐標(biāo)繪制出對應(yīng)的曲線。6~16 h后能抑制培養(yǎng)基內(nèi)病原菌出現(xiàn)明顯生長的最小殼聚糖鹽酸鹽質(zhì)量濃度作為最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 殼聚糖鹽酸鹽的抑菌效力

        采用濾紙片擴(kuò)散法對殼聚糖鹽酸鹽的抑菌性能進(jìn)行測定,結(jié)果見表1。

        表1 殼聚糖鹽酸鹽對3種供試菌的抑菌圈Table 1 Antibacterial circle of chitosan hydrochloride on three tested strains

        由表1可知,殼聚糖鹽酸鹽對所有供試菌都有抑制作用,但殼聚糖鹽酸鹽對供試菌的抑菌作用是有差異的。抑菌效力從大到小依次為副溶血弧菌>哈維氏弧菌>鰻弧菌。

        2.2 不同質(zhì)量濃度的殼聚糖鹽酸鹽對供試菌的抑制作用

        利用菌液作為陽性對照,滅菌培養(yǎng)基作為陰性對照,不同質(zhì)量濃度的殼聚糖鹽酸鹽對供試菌的抑制作用分別見圖1~圖3。

        圖1 不同質(zhì)量濃度的殼聚糖鹽酸鹽溶液對副溶血弧菌生長的影響Fig.1 Effect of different concentrations of chitosan hydrochloride on the growth of V.parahaemolyticu

        圖1 結(jié)果顯示,質(zhì)量濃度 為20 mg/mL、10 mg/mL、5 mg/mL和2.5 mg/mL的殼聚糖鹽酸鹽溶液在前10 h內(nèi)對副溶血弧菌生長具有明顯的抑制作用,隨著溶液質(zhì)量濃度增大抑制作用也明顯變大,在10~16 h內(nèi)20 mg/mL和10 mg/mL質(zhì)量濃度的仍然具有明顯的抑制作用,而5 mg/mL和2.5 mg/mL質(zhì)量濃度的溶液則抑制作用變?nèi)?。連續(xù)培養(yǎng)16 h后,質(zhì)量濃度1.25 mg/mL的殼聚糖鹽酸鹽溶液對副溶血弧菌不再具有抑制作用,因此對副溶血弧菌的最小抑菌質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL。

        圖2 不同質(zhì)量濃度的殼聚糖鹽酸鹽對哈維氏弧菌生長的影響Fig.2 Effect of different concentrations of chitosan hydrochloride on the growth of V.harveyi

        圖2結(jié)果顯示,質(zhì)量濃度為30 mg/mL、15 mg/mL、7.5 mg/mL和3.25 mg/mL的殼聚糖鹽酸鹽溶液在前16 h內(nèi)對哈維氏弧菌具有明顯的抑制作用,并且隨著質(zhì)量濃度的增大抑制作用也逐漸增大。連續(xù)培養(yǎng)16 h后,殼聚糖鹽酸鹽的質(zhì)量濃度為1.625 mg/mL時,對哈維氏弧菌的抑制不再明顯,因此對哈維氏弧菌的最小抑菌質(zhì)量濃度為3.25 mg/mL?;【囊志χ睆阶畲螅虼丝梢哉J(rèn)為殼聚糖鹽酸鹽對副溶血弧菌的抑菌效果最好。殼聚糖鹽酸鹽對副溶血弧菌的最小抑菌濃度為2.5 mg/mL,而對哈維氏弧菌和鰻弧菌的最小抑菌濃度3.25 mg/mL。上述研究為殼聚糖鹽酸鹽運(yùn)用于對蝦弧菌病的防治提供理論依據(jù)。

        殼聚糖在水質(zhì)凈化、抗菌、提高機(jī)體免疫力等方面都具有良好的效果,且其原料豐富,降解產(chǎn)物無毒無害,解決了使用抗生素帶來的殘留和抗藥性問題。因此,其在無公害水產(chǎn)品的養(yǎng)殖生產(chǎn)中有著廣闊的應(yīng)用前景[14-16],但殼聚糖較低的溶解性使其應(yīng)用受到限制。殼聚糖鹽酸鹽是殼聚糖簡單改性后的一種水溶性產(chǎn)物,不但保留了殼聚糖在水質(zhì)凈化、抗菌和提高機(jī)體免疫力等方面的良好效果,而且殼聚糖鹽酸鹽對人體具有保健功能。所以探討殼聚糖鹽酸鹽用于對蝦弧菌病的防治具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。

        圖3 不同質(zhì)量濃度的殼聚糖鹽酸鹽對鰻弧菌生長的影響Fig.3 Effect of different concentrations of chitosan hydrochloride on the growth of V.anguillarum

        圖3結(jié)果顯示,在前6h,質(zhì)量濃度為30mg/mL、15 mg/mL、7.5 mg/mL和3.25 mg/mL的殼聚糖鹽酸鹽對鰻弧菌具有明顯的抑制作用,隨著時間延長,質(zhì)量濃度降低,抑制作用慢慢減弱。連續(xù)培養(yǎng)6 h時,質(zhì)量濃度為1.625 mg/mL殼聚糖鹽酸鹽對鰻弧菌不再具有明顯的抑制作用,因此殼聚糖鹽酸鹽對鰻弧菌的最小抑菌濃度為3.25 mg/mL。

        3 結(jié)論

        目前,防治對蝦弧菌病害的方法主要是藥物防治[11-13],藥物防治雖然具有操作簡單,效果顯著等優(yōu)點(diǎn),但不可避免的會使機(jī)體產(chǎn)生一定的耐藥性,還會對水域環(huán)境造成不同程度的破壞,而且藥物殘留也會對后續(xù)的食品安全造成很大影響。

        本實(shí)驗(yàn)對殼聚糖鹽酸鹽的體外抑菌性能進(jìn)行了研究,采用濾紙片擴(kuò)散法測定了殼聚糖鹽酸鹽對副溶血弧菌、哈維氏弧菌和鰻弧菌的抑菌性能。殼聚糖鹽酸鹽對副溶血

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