康楠 王鳳云 陳婷 王曉鴿 朱恩林 唐旭東

脾的主要生理功能為運(yùn)化水谷、運(yùn)化水液，輸布精微，脾虛證則表現(xiàn)為脾的運(yùn)化、升清功能失職，致使水谷、水液不運(yùn)，水濕潴留，化源不足，進(jìn)而出現(xiàn)腹脹腹痛、食少納呆、便溏腹瀉、浮腫等一系列的癥狀。泄瀉是脾虛證的主癥，是因脾虛失運(yùn)，清濁不分，水濕下注而成。脾虛證的現(xiàn)代研究多從胃腸道動(dòng)力［1］、胃腸激素水平［2］、黏膜免疫［3］、能量代謝［4］等方面進(jìn)行探討，為闡明脾虛證的科學(xué)內(nèi)涵提供了諸多依據(jù)。而從水液代謝的角度探討脾虛泄瀉的發(fā)生機(jī)制的研究還相對較少，本研究擬從這一角度出發(fā)，選擇胃腸道典型的水通道蛋白為研究對象，觀察健脾經(jīng)典方劑參苓白術(shù)散對脾虛泄瀉模型大鼠結(jié)腸黏膜AQP4、AQP8 的表達(dá)情況的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3 周齡清潔劑級健康雄性Wistar 大鼠42 只，北京斯貝福實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，許可證號:SCXK(京)2011-0004。

1.2 主要藥品與試劑

參苓白術(shù)散加減方浸膏干粉(每克干粉含生藥量5.64g)，由中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院藥劑科提供;蒙脫石散，博福-益普生(天津)制藥有限公司，3 g* 10袋，產(chǎn)品批號:F17193。AQP4 一抗(SⅠGMA，A5971)，AQP8 一抗(LⅠBio，LS-C3811/29843)，兔超敏二步法免疫組化檢測試劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，檸檬酸鹽緩沖液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，抗利尿激素ELⅠSA 試劑盒(Cayman，583951)。

1.3 儀器

Olympus bx51 顯微鏡;LEⅠCA EM TP 組織包埋機(jī);LEⅠCA RM 2235 組織切片機(jī);LEⅠCA HⅠ1220 烤片機(jī);THERMO MK3 全自動(dòng)酶標(biāo)儀;Olympus Anymicro DSSTM 圖像采集系統(tǒng)。

1.4 分組與給藥

將大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、蒙脫石散組、加減參苓白術(shù)散高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組7 只，分別按照10 mL/kg 給予生理鹽水、蒙脫石散溶液(0.9 g/kg)、加減參苓白術(shù)散(4.6g/kg)、加減參苓白術(shù)散(2.3 g/kg)、加減參苓白術(shù)散(1.2g/kg)，每天1 次，連續(xù)灌胃7 天。

1.5 模型建立

采用高乳糖飼料喂養(yǎng)疊加水環(huán)境小平臺站立法［5-7］建立脾虛泄瀉大鼠模型，連續(xù)高乳糖飼料喂養(yǎng)幼齡Wistar 大鼠14 天，每天將大鼠置于特制的箱中小平臺上9 小時(shí)，平臺周邊注滿水，大鼠在平臺上可以自由活動(dòng)，一旦大鼠進(jìn)入睡眠狀態(tài)就會(huì)因?yàn)榧∪馐鎻垺⑺沙诙淙胨小?/p>

1.6 取材及處理

連續(xù)灌胃給藥7 天后，4%水合氯醛腹腔麻醉，腹主動(dòng)脈取血，離心取上清。冰上取結(jié)腸組織，至肛門向上2 cm 開始，取遠(yuǎn)端結(jié)腸3 cm，近端結(jié)腸3 cm，用生理鹽水將腸內(nèi)容物清洗干凈后，-80℃保存。

1.7 觀測指標(biāo)

觀察各組大鼠腹瀉率、各組大鼠血清抗利尿激素含量、結(jié)腸組織AQP4 和AQP8 的表達(dá)。血清抗利尿激素含量檢測采用ELⅠSA 方法檢測，根據(jù)說明書進(jìn)行，基本步驟如下:配制標(biāo)準(zhǔn)品，依次梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，加樣，孵育，洗滌，加酶標(biāo)試劑，孵育，洗滌，加工作液顯色，終止顯色，檢測讀取OD 值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算相應(yīng)樣品濃度。AQP4 和AQP8 的表達(dá)采用免疫組化方法檢測，基本步驟如下:脫蠟、預(yù)處理組織切片，3%H2O2去離子水孵育，PBS 沖洗，一抗孵育，PBS 沖洗，二抗孵育，PBS 沖洗，DAB 顯色，自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，分化，自來水沖洗，藍(lán)化，脫水干燥，透明，封片，晾干后觀察。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以表示，各組數(shù)據(jù)先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，采用Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)方法，方差齊性檢驗(yàn)采用Levene 檢驗(yàn)方法，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊，則用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，組間比較用LSD 法;以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的界限。若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布或方差不齊，則用非參數(shù)檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis 檢驗(yàn))，組間兩兩比較用Mann-Whitney 法，由于本實(shí)驗(yàn)分為6 個(gè)組，按照公式重新計(jì)算P =2 ×0.05/k(k-1)=0.003，故以P ＜0.003 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 對大鼠腹瀉情況的影響

模型復(fù)制成功后，大鼠腹瀉率為100%，停止造模并給予治療7 天后，模型組的大鼠大便腹瀉程度較前有所好轉(zhuǎn)，但仍有42.86%的大鼠存在腹瀉情況，而藥物干預(yù)組的大鼠，只有中劑量組的1 只大鼠存在輕微腹瀉，高低劑量組及西藥組大鼠腹瀉情況已消失。(腹瀉率=腹瀉動(dòng)物數(shù)/該組動(dòng)物總數(shù)×100%;干便和稀便的區(qū)分以濾紙上有無污跡為標(biāo)準(zhǔn)。)

2.2 對大鼠血清抗利尿激素含量的影響

高中低劑量組、蒙脫石散組、模型組、正常組血清抗利尿激素含量進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布，但方差不齊(P =0.009 ＜0.05)，故采用非參數(shù)檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis)，組間有顯著性差異(P=0.008 ＜0.05)，組間兩兩比較用Mann-Whitney法。與正常組比較，模型組大鼠血清抗利尿激素的含量明顯降低，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P =0.002 ＜0.003);與模型組比較，加減參苓白術(shù)散高劑量組的大鼠血清抗利尿激素的含量明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.002 ＜0.003)。見表1。

表1 加減參苓白術(shù)散對大鼠血清抗利尿激素含量的影響(n=6)

2.3 對結(jié)腸黏膜組織AQP4 表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸黏膜組織AQP4 的表達(dá)明顯降低;與模型組比較，高中低劑量組及西藥組均可以提高結(jié)腸黏膜組織中AQP4 的表達(dá)。見圖1。

圖1 加減參苓白術(shù)散對結(jié)腸黏膜組織AQP4 表達(dá)的影響(×200)

2.4 對結(jié)腸黏膜組織AQP8 表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸黏膜組織AQP8 的表達(dá)明顯降低;與模型組比較，高低劑量組和西藥組可提高AQP8 的表達(dá)，中劑量組改善不明顯。見圖2。

圖2 加減參苓白術(shù)散對結(jié)腸黏膜組織AQP8 表達(dá)的影響(×200)

3 討論

腹瀉的發(fā)生，可因腸腔內(nèi)滲透壓升高、水電解質(zhì)分泌過度、炎性滲出增多及腸蠕動(dòng)加快，而最終的狀態(tài)都是腸腔內(nèi)的液體量增多。脾虛泄瀉為虛證，大便性狀多為水樣便或者溏薄如醬，且夾有未消化的食物。脾虛泄瀉發(fā)生時(shí)大便中的水分的含量必然是明顯增加的，水分的吸收與分泌可以分為細(xì)胞旁途徑和跨細(xì)胞途徑，無論哪種途徑都是依靠細(xì)胞膜兩側(cè)的滲透壓差來驅(qū)動(dòng)的。其中細(xì)胞旁途徑，水分主要是通過細(xì)胞間隙進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn);跨細(xì)胞途徑水分則需要特定的通道進(jìn)出細(xì)胞，即水通道蛋白［8］。

水通道蛋白是由Agre 等［9］在1992年發(fā)現(xiàn)的，和經(jīng)典的離子通道有些不同，水通道蛋白不存在開放和關(guān)閉的功能狀態(tài)，也不受溫度和脂質(zhì)膜成分的影響，只要有滲透壓梯度就有水分子順滲透壓梯度通過水孔通道［10］。根據(jù)對水和其他溶質(zhì)的通透性，水通道蛋白又分成了水通道和水甘油通道，水通道只對水有通透性，水甘油通道還對其他小分子如甘油等同樣具有通透性，AQP4 和AQP8 屬于前者。AQP4 定位在細(xì)胞的基底膜［11］，有高度快速轉(zhuǎn)運(yùn)水的能力，是其他水通道蛋白通透性的3 ～4 倍［12］。AQP8 定位在細(xì)胞的頂膜下的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)［13］，且研究發(fā)現(xiàn)AQP4、AQP8 的表達(dá)從結(jié)腸隱窩到表面逐漸增加，對水的滲透性也逐漸升高［14］。很多研究表明，AQP4、AQP8 參與了腸道對水分的吸收過程［15-17］，在諸多疾?。?8-20］的發(fā)生過程中也起到了重要的作用，比如說霍亂引起的腹瀉、腸易激綜合征、克羅恩病等。

本研究中以高乳糖飼料喂養(yǎng)法疊加小平臺站立法復(fù)制脾虛泄瀉模型，大鼠被迫勞倦過度且飲食不節(jié)，造成脾虛，引起腹瀉。造模成功后再給予經(jīng)典的健脾方劑參苓白術(shù)散的加減方進(jìn)行治療，并以蒙脫石散做為對照藥物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常組相比，模型組大鼠的AQP4 和AQP8 在結(jié)腸黏膜組織上皮細(xì)胞的表達(dá)均降低，這說明AQP4、AQP8 的表達(dá)降低可能與腹瀉的發(fā)生有關(guān)。與參苓白術(shù)散高中低劑量組及西藥組比較，給予干預(yù)后腹瀉明顯減輕的同時(shí)AQP4、AQP8 的表達(dá)也都上升，這進(jìn)一步證明了腹瀉發(fā)生與AQP4、AQP8 的表達(dá)降低有關(guān)，健脾方劑參苓白術(shù)散加減方可能可以通過上調(diào)AQP4、AQP8 的表達(dá)，促進(jìn)水分吸收，進(jìn)而發(fā)揮其止瀉的作用，療效與西藥蒙脫石散相當(dāng)。本研究小組擬在下一步的工作中，添加“急性感染性腹瀉(非脾虛)組”以及“非健脾中藥組”進(jìn)行模型及藥物反證，針對“AQP4、AQP8 是否為脾虛泄瀉發(fā)生的分子生物學(xué)基礎(chǔ)之一”的問題做進(jìn)一步研究。

另外，本研究還檢測了各組大鼠血清中抗利尿激素的含量，結(jié)果表明與正常組比較，模型組大鼠血清抗利尿激素的含量顯著降低(P ＜0.01)，與模型組比較，高劑量組抗利尿激素含量明顯上調(diào)(P ＜0.01)?？估蚣に厥菣C(jī)體調(diào)節(jié)水液代謝的重要激素，主要作用于遠(yuǎn)曲小管和集合管，提高對水的通透性，促進(jìn)水的吸收。目前研究發(fā)現(xiàn)其受體分布于血管平滑肌、遠(yuǎn)曲小管、集合管、垂體及胰腺［21］，以及某些腫瘤細(xì)胞上也有抗利尿激素受體的表達(dá)［22］，尚未發(fā)現(xiàn)腸道上皮細(xì)胞有抗利尿激素受體的表達(dá)。脾虛腹瀉大鼠血清抗利尿激素含量降低，這是否與脾虛證有關(guān)，或者與腸道AQPs 的表達(dá)變化是否有關(guān)，尚待進(jìn)一步的探討。

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