黃義山蔡燕易成鳳嚴成燕蘇忠龍廖濤陳金文趙明才熊元

四川北部地區(qū)腸桿菌科細菌產(chǎn)ESBLs CTX-M亞型研究

黃義山1蔡燕1易成鳳2嚴成燕2蘇忠龍1廖濤1陳金文1趙明才1熊元1

【摘要】目的 了解川北地區(qū)臨床分離的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶( ESBLs）CTX-M型亞型的分布情況。方法 選取CTX-M型的42株大腸埃希菌和14株肺炎克雷伯菌作為研究對象，對PCR擴增CTX-M耐藥基因陽性者行DNA測序，測序結果在Genebank中進行比對。結果 42株大腸埃希菌中有30株出現(xiàn)CTX-M基因陽性條帶，6株弱陽性；14株肺炎克雷伯菌，5株出現(xiàn)CTX-M陽性條帶，2株弱陽性。ESBLs分子表型流行以CTX-M-14型為主，其次為CTX-M-3型,且發(fā)現(xiàn)1株OXY-2型；VITEK AES耐藥表型判斷的準確性達76.8%。結論 川北地區(qū)ESBLs分子表型中CTX-M-14型流行情況嚴重，應進一步加強消毒隔離措施和流行菌株的控制。

【關鍵詞】超廣譜β-內(nèi)酰胺酶；CTX-M基因型；大腸埃希菌；肺炎克雷伯菌

作者單位：1 637000四川，川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科；2 637000四川，川北醫(yī)學院檢驗系

南充市科學技術和知識產(chǎn)權局，項目基金號：14A0049

近年來，在第三代（超廣譜）頭孢菌素選擇性壓力下，產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）的菌株不斷增加，這些菌株表現(xiàn)出多重耐藥性，最常見于大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌。我國由于頭孢噻肟和頭孢曲松的大量使用，臨床分離到的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌往往表現(xiàn)為對頭孢噻肟耐藥而對頭孢他啶敏感的不典型的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶，主要為CTX-M型和SHV型[1]，而CTX-M型又有多種亞型。為了解川北地區(qū)CTX-M亞型的分布情況，對我院臨床分離得到的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌產(chǎn)CTM-X型ESBL進行基因型檢測，以了解其流行分布情況。

1　資料與方法

1.1菌株來源

收集2012年1月～2012年6月我院住院及門診感染患者送檢的痰、中段尿、胸腹水和各種創(chuàng)面分泌物中分離出，經(jīng)Vitek-32儀器鑒定為CTX-M型的大腸埃希菌42株和肺炎克雷伯菌14株,按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》第2版常規(guī)培養(yǎng)分離并于-70℃冰箱保存菌株.

1.2方法

將凍存的菌株復蘇后，制作細菌DNA模板。根據(jù)參考文獻引物[2]進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳后Bio．Rad凝膠成像儀檢測。每組選取一株CTX-M基因擴增產(chǎn)物送上海生工生物工程技術有限公司測序，測序結果在Genebank經(jīng)比對確定其基因型。

2　結果

2.1CTX-M PCR擴增結果

42株大腸埃希菌經(jīng)儀器檢測可疑產(chǎn)ESBLs的菌株經(jīng)CTX-M特異性引物擴增后，有30株擴增出陽性條帶，6株弱陽性；14株肺炎克雷伯菌，5株擴增出陽性條帶，2株弱陽性，所有結果均重復試驗，兩次結果均無明顯差異。見圖1。

圖1 部分CTX-M型陽性PCR產(chǎn)物電泳圖

M：Marker 2 000，泳道1-16為部分菌株CTX-M引物擴增結果，其中泳道2、14、16為弱陽性，其余在544 bp左右出現(xiàn)的條帶均為CTX-M型陽性。

2.2ERIC-PCR擴增結果

圖2 部分菌株ERIC-PCR電泳圖

表1 CTX-M基因的兩種PCR擴增方法比較（株）

根據(jù)條帶位置完全一致判斷為同一克隆株[3]，5株肺炎克雷伯菌屬于獨立基因型；30株大腸埃希菌分為20個組，15株屬獨立基因型,共25組，部分電泳圖左邊6株為肺炎克雷伯菌，右邊11株為大腸埃希菌。見圖2。

2.3CTX-M基因型測序結果

PCR擴增CTX-M基因，經(jīng)方法1擴增出的基因產(chǎn)物，25株有9株測序成功；于是采用方法2，11株擴增成功的產(chǎn)物有10株測序成功。其擴增過程中各階段的溫度和反應時間以及循環(huán)次數(shù)均與方法1相同。見表1。

用兩種方法共測序成功19株,測序結果在Genebank經(jīng)DNA ssist 1.02比對，結果顯示共有3種序列，其中16株（包括13株大腸埃希菌和3株肺炎克雷伯菌）序列與CTX-M-14、125、65、24、104、90、130比對一致，2株（兩種細菌各占1株）序列與CTX-M-3、136、22、116、15、32比對一致，1株肺炎克雷伯菌序列與OXY-2比對一致。

3　討論

我國CTX-M檢出率在許多地方均較高，本實驗將實驗室經(jīng)Vitek-32微生物分析儀檢測提示為CTX-M型的42株大腸埃希菌和14株肺炎克雷伯菌用CTX-M基因特定引物擴增，大腸埃希菌有30株出現(xiàn)CTX-M基因陽性條帶，6株弱陽性；肺炎克雷伯菌有5株出現(xiàn)CTX-M陽性條帶，2株弱陽性，總體陽性擴增率為76.8%。

CTX-M PCR采用方法1擴增后，條帶之間強弱有明顯差異，重復擴增，條帶強弱并無明顯改變，3株強度較弱的條帶最終測序也失敗；采用方法2行CTX-M PCR擴增后，條帶強度較一致，且較明顯，但方法1中呈弱陽性的用方法2擴增后卻為陰性，由此可見，該基因PCR擴增條件除與溫度和時間等可控因素有關外，或許還與地域環(huán)境等其它未知因素有關。

根據(jù)近兩年各個地方分析的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的ESBLs基因型可知，我們國家以CTX-M-14型最為常見，本實驗將CTX-M基因擴增成功的菌株采用ERIC-PCR初步將30株大腸埃希菌分為20個基因型，5株肺炎克雷伯菌各為一型。每型選取一株CTX-M PCR產(chǎn)物測序，最終結果顯示，川北地區(qū)產(chǎn)ESBLs大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌主要以CTX-M-14型為主，其次為CTX-M-3型，值得一提的是本次實驗發(fā)現(xiàn)1株肺炎克雷伯菌序列與OXY-2比對一致。而各種亞型間耐藥性是否存在差異將在下一步實驗中進一步分析比較。

參考文獻

[1] 陳賢云，夏春，薛蓮． 產(chǎn)超廣譜B-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的分布及耐藥性分析[J]． 國際檢驗醫(yī)學雜志，2011，32（20）：2397-2398．

[2] 張玲，曹銀元. 大腸埃希菌臨床分離株CTX-M型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因型研究[J].中國微生態(tài)學雜志，2009，21（9）：836-837.

[3] 陳定強，彭玉婷，羅毓婷，等. 多重耐藥菌中β-內(nèi)酰胺酶的基因型研究[J]. 檢驗醫(yī)學與臨床，2013，10（1）：1-3.

Study on Sichuan North Area Enterobacteriaceae Bacteria subType
of Produce ESBLs CTX-M

HUANG Yishan1CAI Yan1YI Chengfeng2YAN Chengyan2SU Zhonglong1LIAO Tao1CHEN Jinwen1ZHAO Mingcai1XIONG Yuan21 North Sichuan Medical College Affiliated Hospital Laboratory Department in Sichuan Province, Sichuan 637000, China 2 North Sichuan Medical College Test System in Sichuan Province, Sichuan 637000,China

[Abstract]Objective To investigate north area the clinical isolates of escherichia coli and klebsiella pneumoniae producing extended spectrum B- lactamases (ESBLs) distribution of CTX-M-type subtype. Methods Selected 42 CTX-M-type escherichia coli and 14 klebsiella pneumoniae as the research object, CTX-M-positive resistance gene was amplified by PCR for DNA sequencing, sequencing results were compared in the Genebank. Results 30 CTX-M gene positive bands appeared in 42 E.coli, 6 had weakly positive, 5 appear CTX-M positive bands in 14 klebsiella pneumoniae, 2 had weakly positive. ESBLs molecular phenotype popular with CTX-M-14 type, followed by the CTX-M-3 type, and found an OXY-2 type, VITEK AES resistant phenotype to determine the accuracy of up to 76.8%. Conclusion The North Region ESBLs molecular phenotype in CTX-M-14-type epidemic situation is serious, it should further strengthen disinfection and isolation measures and control of the epidemic strain.

[Key words]Extended-spectrum β-lactamase, CTX-Mgenotypes, Escherichia coli, Klebsiella pneumonia

doi：10.3969/j.issn.1674-9308.2015.13.015

【文章編號】1674-9308（2015）13-0020-02

【文獻標識碼】B

【中圖分類號】R181.3