王　霞，韓　偉，葛　斌，吳勇杰

(1.蘭州大學基礎醫(yī)學院藥理學研究所，甘肅省新藥臨床前研究重點實驗室，甘肅蘭州　730000; 2.甘肅省人民醫(yī)院，甘肅蘭州　730000;3.甘肅中醫(yī)學院定西校區(qū)，甘肅定西　743000)

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蛇葡萄素鈉聯(lián)合卡鉑對人肺腺癌GLC-82細胞增殖及凋亡的影響

王霞1，2，韓偉3，葛斌2，吳勇杰1

(1.蘭州大學基礎醫(yī)學院藥理學研究所，甘肅省新藥臨床前研究重點實驗室，甘肅蘭州730000; 2.甘肅省人民醫(yī)院，甘肅蘭州730000;3.甘肅中醫(yī)學院定西校區(qū)，甘肅定西743000)

摘要:目的探討蛇葡萄素鈉(AMP-Na)單用及其與卡鉑(CBP)合用對人肺腺癌GLC-82細胞增殖的抑制作用及可能的機制。方法四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法測定兩藥單用及合用對GLC-82細胞的體外殺傷活性;透射電子顯微鏡(TEM)觀察GLC-82細胞超微結構的變化;流式細胞儀(FCM)檢測GLC-82細胞凋亡和caspase-3的表達。結果對于GLC-82細胞，AMP-Na與CBP合用，CBP的IC(50)由(17.10±4.78) mg·L(－1)降低到＜3.12 mg·L(－1)(P＜0.01)，表明Amp-Na對卡鉑抑制GLC-82細胞增殖的作用具有協(xié)同效應(CDI＜1)。TEM及FCM檢測結果表明，單用AMP-Na及與卡鉑合用均可誘導GLC-82細胞凋亡、壞死，兩藥合用后壞死率由(2.56±0.41) %升高到(71.83± 5.43) % (P＜0.01)。AMP-Na單用及與卡鉑合用作用于GLC-82細胞48 h后，caspase-3的表達均明顯增高。結論AMP-Na和CBP具有協(xié)同誘導GLC-82細胞凋亡的作用，機制可能與激活細胞內caspase-3介導的信號轉導通路相關。

關鍵詞:蛇葡萄素鈉;卡鉑;人肺腺癌GLC-82細胞;細胞凋亡;細胞壞死; caspase-3

蛇葡萄素(ampelopsin)是存在于葡萄科植物中的一類重要的黃酮類化合物。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，蛇葡萄素具有體內外抗腫瘤、消炎鎮(zhèn)痛、祛痰止咳、保肝護肝等作用［1－2］。蛇葡萄素鈉(ampelopsin sodium，AMP-Na)是本實驗室為了提高蛇葡萄素的溶解性及穩(wěn)定性，使其成為更適合臨床使用的藥物劑型而制備的高水溶性鈉鹽。AMP-Na聯(lián)合卡鉑(CBP)后對腫瘤細胞的作用是否有改變，目前尚不確定，所以在前期實驗的基礎上，采用MTT法研究AMP-Na與CBP合用對人肺腺癌GLC-82細胞的細胞毒作用，應用流式細胞儀檢測其對細胞凋亡的影響，初步探討AMP-Na與CBP合用對GLC-82細胞增殖的抑制作用及機制。

1　材料與方法

1.1藥品與試劑蛇葡萄素鈉(AMP-Na)凍干劑:每支50 mg，批號:051115，純度98.8 %; AMP-Na凍干劑專用稀釋液(0.1 mol·L－1，pH=6.8磷酸鹽緩沖液:每支5 mL，批號051118)，均由廣東泰禾醫(yī)藥科技有限公司提供。卡鉑:江蘇齊魯制藥有限公司產(chǎn)品，批號:5090061 DA。新生小牛血清:杭州四季青生物工程有限公司產(chǎn)品，批號: 050126。RPMI 1640培養(yǎng)基: Gibco Invitrogen Corporation，USA產(chǎn)品。MTT: Fluka公司產(chǎn)品，用pH=7.4的PBS配制成5 g·L－1，過濾除菌分裝，4℃保存(2周內有效)。

1.2細胞系人肺腺癌GLC-82細胞，購自中科院上海細胞生物研究所細胞庫。

1.3儀器CO2培養(yǎng)箱: Shellab 2306、Shellab 2323均為USA產(chǎn)品。超凈工作臺: SW-CJ-IFD蘇州凈化設備有限公司產(chǎn)品。ELX800型酶聯(lián)免疫檢測儀: USA產(chǎn)品。流式細胞儀: Coulter Epics XL型，Beckman-Coulter Inc，F(xiàn)ullerton，CA，USA產(chǎn)品。倒置顯微鏡: OLYMPUS產(chǎn)品。透射電子顯微鏡: JEN-100CX日本電子公司產(chǎn)品。高速離心機: Anke TDl-5上海安亭科學儀器廠產(chǎn)品。

1.4MTT比色法測定AMP-Na單用及與CBP合用對人肺腺癌GLC-82細胞增殖的抑制作用取對數(shù)生長期(傳代后24～48 h)的GLC-82細胞，用0.25 %的胰蛋白酶消化、離心(1 000 r·min－1，5 min)，棄上清液，保留細胞沉淀，在細胞沉淀中加RPMI 1640培養(yǎng)液調整各細胞濃度至5×107·L－1，在96孔培養(yǎng)板中以每孔90 μL加入細胞懸液，培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后每孔加入藥物10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。于實驗終止前4 h每孔加入MTT 10 μL，實驗終止時每孔加入10 % SDS 100 μL，置37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中過夜，次日先震蕩10 min，然后于波長570 nm處測定吸光值。根據(jù)下式計算抑制率和藥物相互作用指數(shù)(CDI)，并計算IC50值。

本實驗數(shù)據(jù)中陰性OD值為減去空白對照的值，受試藥OD均值為減去顏色對照的值。藥物相為兩藥聯(lián)合用藥組與對照組570 nm吸光值的比值，A或B是各藥單獨用藥組與對照組570 nm吸光值的比值。當CDI＜1時，兩藥有協(xié)同作用;當CDI＜0.7時，協(xié)同作用非常顯著; CDI=1，則兩藥作用性質為相加; CDI＞1時，則兩藥作用性質為拮抗)。本實驗整體分為5組，具體實驗設計如下:陰性對照組: RPMI 1640完全培養(yǎng)液+細胞+溶媒(pH=6.8 PBS) ;陽性對照組: RPMI 1640完全培養(yǎng)液+細胞+ CBP;空白對照組: RPMI 1640完全培養(yǎng)液+溶媒;受試藥組: RPMI 1640完全培養(yǎng)液+細胞+ AMP-Na系列濃度; RPMI 1640完全培養(yǎng)液+細胞+50 mg·L－1的AMP-Na+ CBP系列濃度; AMP-Na顏色對照組: RPMI 1640完全培養(yǎng)液+50 mg·L－1的AMP-Na。每個組的每個濃度設3個復孔，以3個復孔OD值的均數(shù)作為一次實驗的數(shù)據(jù)。

1.5流式細胞儀檢測細胞凋亡和caspase-3的表達

取對數(shù)生長期的GLC-82細胞，用含10 %小牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)液調節(jié)細胞濃度1×108·L－1，以每瓶9 mL接種100 mL容量的6個培養(yǎng)瓶內，分別作為陰性對照組、卡鉑對照(25 mg·L－1)組、AMP-Na (50 mg·L－1)單用組、AMP-Na (100 mg·L－1)單用組、AMP-Na (50 mg·L－1)+卡鉑(25 mg·L－1)組、AMP-Na (100 mg·L－1)+卡鉑(25 mg·L－1)組。培養(yǎng)24 h待細胞貼壁后，分別以每瓶1 mL加入藥物或生理鹽水，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。實驗終止時，先將培養(yǎng)液離心(室溫，1 000 r·min－1，5 min)棄上清，保留細胞沉淀;再用0.25%胰蛋白酶消化貼壁細胞，在顯微鏡下觀察當細胞間隙增大、胞質回縮、胞核變圓(約2～3 min)后，加含10 %小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中止消化，用吸管吹打均勻后將含細胞的培養(yǎng)液離心(1 000 r·min－1，5 min)，混合所得細胞沉淀，制備樣本，用Multicycle軟件分析，計算凋亡細胞百分數(shù)和各細胞周期百分數(shù)及caspase-3的表達;用FACScan進行流式細胞術檢測分析。

2　結果

2.1細胞增殖抑制試驗實驗結果表明，AMP-Na 對GLC-82細胞的增殖具有明顯的抑制作用，有濃度依賴性。AMP-Na 50 mg·L－1與卡鉑系列濃度合用后，對GLC-82細胞的抑制率較兩者單用時均增高，表明AMP-Na可以協(xié)同卡鉑抗GLC-82細胞的增殖。見Tab 1。

Tab 1 Inhibition effects and IC50of AMP-Na or combinedwith carboplatin on GLC-82 cells(±s，n=9)

Tab 1 Inhibition effects and IC50of AMP-Na or combinedwith carboplatin on GLC-82 cells(±s，n=9)

＊＊P＜0.01 vs negative group;△P＜0.05，△△P＜0.01 vs AMPNa;#P＜0.05，##P＜0.01 vs carboplatin

Negative control　0 Carboplatin　3.12　1.5±13.28 Carboplatin　6.25　7.9±7.99 Carboplatin　12.5　30.5±4.16＊＊Carboplatin　25　80.4±2.80＊＊Carboplatin　50　88.6±5.06＊＊AMP-Na　25?。?3.0±9.37 AMP-Na　50　47.0±17.41＊＊AMP-Na　100　75.2±3.92＊＊AMP-Na　200　81.0±2.89＊＊AMP-Na+ CBP　50+3.12　63.5±11.37＊＊##AMP-Na+ CBP　50+6.25　69.7±0.11＊＊#AMP-Na+ CBP　50+12.5　67.7±18.45＊＊△##AMP-Na+ CBP　50+25　84.6±1.44＊＊△△##AMP-Na+ CBP　50+50　91.7±3.31＊＊△△#IC50of AMP-Na　57.39±17.35 IC50of CBP　17.10±4.78 IC50of AMP-Na+ CBP＜3.12

2.2Annexin V/PI雙染法檢測凋亡Annexin-VFITC/PI雙標檢測顯示，藥物作用48 h后，陰性對照組活細胞、凋亡細胞、壞死細胞占總細胞的百分比分別為(98.3±0.45) %、(0.53±0.13) %和(0.39± 0.34) %?？ㄣK25 mg·L－1處理組活細胞明顯減少，凋亡細胞明顯增多。100 mg·L－1的AMP-Na單用組及與卡鉑合用組，幾乎沒有活細胞，大部分細胞處于壞死狀態(tài)，尚有部分處于凋亡狀態(tài)(Tab 2、Fig 1)。

實驗結果表明，100 mg·L－1的AMP-Na作用于GLC-82細胞48 h后，大部分細胞處于凋亡和壞死狀態(tài)。由于100 mg·L－1的AMP-Na單獨使用時就產(chǎn)生了強大的細胞毒作用，所以其與卡鉑合用后對GLC-82細胞的作用與卡鉑單用比較，無明顯變化(P＞0.05)。

2.3AMP-Na單用及與卡鉑合用對GLC-82細胞caspase-3表達的影響卡鉑25 mg·L－1、AMP-Na 100 mg·L－1處理GLC-82細胞48 h后，caspase-3的表達均明顯增高，與陰性對照組比較，差異有顯著性(P＜0.01)。AMP-Na 100 mg·L－1與卡鉑25 mg· L－1聯(lián)合用藥組細胞，caspase-3的表達明顯增高，與陰性對照組比較，差異有顯著性(P＜0.01)，與卡鉑25 mg ·L－1比較，無明顯變化(P＞0.05)。見Tab 3、Fig 2。

Fig 1 Apoptotic rate of GLC-82 cells in different groups

Tab 2 Apoptosis and necrosis ratio of GLC-82 cells induced by AMP-Na or combined 48 h with carboplatin (珋±s，n=3)

Tab 2 Apoptosis and necrosis ratio of GLC-82 cells induced by AMP-Na or combined 48 h with carboplatin (珋±s，n=3)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs negative group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs carboplatin group

Apoptotic cells　0.53±0.13　85.83±6.39＊＊#　26.53±14.61* ##　27.33±5.67＊＊##Necrotic cells　0.39±0.34　2.56±0.41＊＊#　72.87±14.34＊＊##　71.83±5.43＊＊##

Tab 3 Expression of caspase-3 induced by AMP-Na or combined with carboplatin on GLC-82 cells±s，n=3)

Tab 3 Expression of caspase-3 induced by AMP-Na or combined with carboplatin on GLC-82 cells±s，n=3)

＊＊P＜0.01 vs negative group

Caspase-3　Control　CBP(25 mg·L－1)　AMP-Na(100 mg·L－1)AMP-Na+ CBP Positive rate/%　57.87±5.30　97.70±0.95＊＊　80.00±3.82＊＊　97.43±2.97＊＊MFI　2.32±0.13　3.97±0.40＊＊　3.03±0.13＊＊　4.81±0.98＊＊

Fig 2 The expression of caspase-3 in different groups

2.4透射電鏡觀察細胞形態(tài)的變化陰性對照組GLC-82細胞胞膜完整，微絨毛豐富，胞質中細胞器豐富，核膜清晰完整，染色質均勻分布(Fig 3A) ;卡鉑處理組細胞胞膜完整，微絨毛減少，核膜清晰，線粒體擴張，胞質中出現(xiàn)大量空泡(Fig 3B) ; AMP-Na單用組，細胞表面光滑，微絨毛消失，細胞核固縮，核質比例增大，染色質凝集為團塊狀，分布與核膜邊緣呈月牙狀，細胞內出現(xiàn)大量空泡，線粒體腫脹(Fig 3C) ; AMP-Na與卡鉑聯(lián)用組，細胞膜表面的微絨毛明顯減少，線粒體明顯腫脹，染色質凝集并邊集于核膜(Fig 3D)。

3　討論

近年來肺癌已成為惡性腫瘤患者死亡的主要疾病，其中非小細胞肺癌(NSCLC)占肺癌發(fā)病率的80%左右，預后較差，而化療是晚期NSCLC的主要治療方法，以鉑類藥物為基礎的聯(lián)合化療雖能改善晚期NSCLC患者的生存期、癥狀和生活質量，但其療效已經(jīng)達到了平臺期［3］，提高療效關鍵在于推出高效低毒的新藥。目前對于NSCLC的治療，主張應用聯(lián)合化療，含鉑方案目前是治療晚期NSCLC的標準方案。但含鉑方案有抗瘤譜窄、易產(chǎn)生耐藥性等缺點，主要不良反應有骨髓抑制、消化道反應、脫發(fā)、腎毒性、肝毒性、神經(jīng)毒性等［4－5］。由于以上原因，使得卡鉑在臨床上的使用受到限制。據(jù)國外報道，在臨床上與卡鉑協(xié)同用藥可使預后差的許多腫瘤得到有效治療［6－7］。所以找到一種與卡鉑等化療藥物具有協(xié)同作用且低毒的藥物，在提高其療效的作用下，同時能大大降低其用藥劑量，以克服其在臨床使用中的不良反應、提高患者療效是非常有意義的。本實驗結果表明，50 mg·L－1的AMP-Na單用，對GLC-82細胞的IR為(53.6±11.07) %?？ㄣK3.12～12.5 mg·L－1單用的IC50為(17.10±4.78) mg ·L－1。AMP-Na 50 mg·L－1與卡鉑3.12～12.5 mg ·L－1合用時，卡鉑對GLC-82細胞的IC50＜3.12 mg ·L－1。表明50 mg·L－1的AMP-Na對卡鉑抑制GLC-82細胞增殖的作用具有協(xié)同效應，且主要對低、中濃度的卡鉑協(xié)同作用較強。

Fig 3 Ultrastructure change of apoptotic GLC-82 cells with transmission electron microscope (48 h，×10 000)

隨著科學研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)凋亡在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展上也起著重要作用。目前的抗腫瘤藥物作用主要有直接殺死或抑制腫瘤細胞生長，以及誘導腫瘤細胞凋亡兩個方面。而是否能引起腫瘤細胞凋亡又是評價化療藥物優(yōu)劣的重要指標。本實驗通過透射電鏡觀察可見，AMP-Na處理組及與卡鉑聯(lián)用組出現(xiàn)典型的凋亡相關的形態(tài)學變化，這說明AMP-Na可誘導GLC-82細胞凋亡，是其抗腫瘤作用機制之一。細胞凋亡的發(fā)生是一個極其復雜的過程，受多種機制調節(jié)和制約。凋亡發(fā)生機制中最關鍵的環(huán)節(jié)之一是caspase的激活，而caspase-3是目前已知與凋亡關系最密切的caspase家族成員之一。本實驗結果表明，AMP-Na可以活化細胞內的caspase-3，而活化的caspase-3能裂解DNA修復相關分子、凋亡抑制蛋白、細胞外基質蛋白及骨架蛋白等，促使細胞凋亡。此外，由于caspase-3是多種凋亡途徑共同作用的因子，其蛋白表達水平的高低決定著細胞凋亡程度［9］。所以本實驗結果提示，AMPNa誘導腫瘤細胞凋亡的機制之一可能是通過激活細胞內的caspase-3介導的信號轉導通路，從而促進凋亡的發(fā)生。總之，細胞凋亡的發(fā)生是一個極其復雜的過程，有關AMP-Na誘導腫瘤細胞凋亡的機制還有待進一步研究。

參考文獻:

［1］周春權，姚欣，陳曉明，倪峰.藤茶提取物的抗腫瘤作用研究［J］.中藥新藥與臨床藥理，2011，22(6) :640－2.

［1］Zhou C Q，Yao X，Chen X M，Ni F.Studies on anti-tumor effect of ampelopsis grossedentata extracts［J］.Tradit Chin Drug Res Clin Pharmacol，2011，22(6) :640－2.

［2］張瓊，劉德育.蛇葡萄素改變Bcl2/Bax表達和激活caspase-3誘導人肝癌細Bel27402凋亡［J］.中國藥理學通報，2009，25 (11) :1502－6.

［2］Zhang Q，Liu D Y.Ampelopsin induces apoptosis via altering expression of Bcl-2/Bax and activating caspase-3 in human hepatoma cell line Bel-7402［J］.Chin Pharmacol Bull，2009，25(11) :1502 －6.

［3］王萍，宋玉仙，竇精杰，候亞義.新化合物D261抑制非小細胞肺癌NCI-H460細胞增殖及其作用機制［J］.中國藥理學通報，2013，29(3) :442－3.

［3］Wang P，Song Y X，Dou J J，Hou Y Y.Inhibitory effect of a novel compound D261 on human NSCLC NCI-H460 cells［J］.Chin Pharmacol Bull，2013，29(3) :442－3.

［4］Pal S K，F(xiàn)iglin R A，Reckamp K.Targeted therapies for non-small cell lung cancer: an evolving landscape［J］.Mol Cancer Ther，2010，9(7) :1931－44.

［5］饒進軍，何關生，毛楠，鐘小懿.沉默EZH2表達逆轉人非小細胞肺癌順鉑耐藥性［J］.中國藥理學通報，2014，30(8) : 1084 －90.

［5］Rao J J，He G S，Mao N，Zhong X Y.Reverse effect of silencing EZH2 expression on human cisplatin-resistant non small cell lung cancer［J］.Chin Pharmacol Bull，2014，30(8) :1084－90.

［6］Isabelle M，Patrick S，Hubert C，et al.PhaseI/Ⅱstudy of escala-［8］ting dose of vinorel binein combination with oxaliplation with inpatiens with advanced non-small cells lung cancer［J］.J Clin Oncol，2001，19(2) :485－63.

［7］孫華燕，徐風華，郭榮榮.吉西他濱聯(lián)合鉑類與其他含鉑方案治療非小細胞肺癌的Meta分析［J］.中國現(xiàn)代應用藥學，2014，31(7) :884－90.

［7］Sun H Y，Xu F H，Guo R R.Gemcitabine plus platinum chemotherapy compared with other platinum containing regimens in advanced non-small-cell lung cancer: a Meta-analysis of survival outcomes［J］.Chin J Mod Appl Pharm，2014，31(7) :884－90.

［8］Mimeault M，Hauke R，Batra S K.Recent advances on the molecular mechanisms involved in the drug resistance of cancer cells and novel targeting therapes［J］.Clin Pharmacol Ther，2008，83(5) : 673－91.

［9］施劍明，殷嫦嫦，孫維君，杜桂花.槲皮素聯(lián)合順鉑對人骨肉瘤MG-63細胞增殖及凋亡的影響［J］.中國藥理學通報，2014，30(10) :1361－6.

［9］Shi J M，Yin C C，Sun W J，Du G H.Effect of combined with cisplatin on proliferation and apoptosis of human osteosarcoma cell line MG-63［J］.Chin Pharmacol Bull，2014，30(10) :1361－6.

Effect of ampelopsin sodium combined with carboplatin on the proliferation and apoptosis of human lung adenocarcinoma cell GLC-82

WANG Xia1，2，HAN Wei3，GE Bin2，WU Yong-jie1
(1.Dept of Pharmacology，School of Basic Medical Science，Gansu Key Laboratory of Preclinical Study for New Drugs，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China;2 Dept of Pharmacy，Gansu Provincial Hospital，Lanzhou 730000，China; 3.Dingxi Campus of Gansu University of Traditional Chinese Medicine，Dingxi Gansu 743000，China)

Abstract:AimTo investigate the cytotoxic effect and mechanism of ampelopsin sodium (AMP-Na) on human lung adenocarcinoma cell line GLC-82 alone or combined with carboplatin (CBP).MethodsThe cytotoxic effect of human lung adenocarcinoma cell line GLC-82 was investigated by 3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl) -2，5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) colorimetric assay.Ultrastructure change of apoptotic GLC-82 cells was observed with transmission electron microscope.The changes of the cell apoptosis and the expression of caspase-3 were analyzed with flow cytometer.ResultsCombined with AMP-Na，the IC(50)of CBP decreased from (17.10±4.78) mg·L(－1)to＜3.12 mg·L(－1)(P＜0.01)，showed that the combination of AMP-Na and CBP had synergistic effect on GLC-82 cells (CDI＜1).As with transmission electron microscope and flow cytometric analysis，the apoptosis and necrosis ratios also increased in the combination group.The necrosis ratios increased from (2.56± 0.41) % to (71.83±5.43) % (P＜0.01).The expression of caspase-3 was increased significantly after treated with AMP-Na or combined with CBP.Conclusions There is a synergistic cytotoxic effect on GLC-82 cells treated with AMP-Na combined with CBP.Apoptotic cells and necrotic cells are found in GLC-82 cells treated with AMP-Na alone or combined with CBP.One of the mechanisms to induce apoptosis is probably that activation of caspase-3 mediates signal transduction pathway in cells.

Key words:ampelopsin sodium; carboplatin; human lung adenocarcinoma cell line GLC-82; apoptosis; necrosis;caspase-3

作者簡介:王霞(1980－)，女，碩士，主管藥師，研究方向:藥理學、臨床藥學，Tel: 0931-8281726，E-mail: wangx-2008 @ 163.com;吳勇杰(1955－)，男，教授，博士生導師，研究方向:腫瘤藥理學，通訊作者，Tel: 0931-8915092，E-mail: wuyj@ lzu.edu.cn

基金項目:廣東省科技廳省部產(chǎn)學研合作項目(No 2007A090302025)

收稿日期:2015－01－31，修回日期:2015－03－10

文獻標志碼:A

文章編號:1001－1978(2015) 06－0838－06中國圖書分類號: R329.24; R329.25; R734.202; R734.205.3; R979.1

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.06.020