田　崛，陳顯凌，莊英婷，范瑩娟，許建華，吳麗賢

(1.福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理系，福建福州　350004;2.福建省天然藥物藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州　350004; 3.福建醫(yī)科大學(xué)新藥研究所，福建福州　350004;4.福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院血液科，福建福州　350001; 5.福建省血液病研究所，福建福州　350001)

?

BMS-345541對急性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞DNA損傷修復(fù)的影響

田崛1，2，3，陳顯凌4，5，莊英婷1，2，3，范瑩娟1，2，3，許建華1，2，3，吳麗賢1，2，3

(1.福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理系，福建福州350004;2.福建省天然藥物藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州350004; 3.福建醫(yī)科大學(xué)新藥研究所，福建福州350004;4.福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院血液科，福建福州350001; 5.福建省血液病研究所，福建福州350001)

摘要:目的體外研究BMS-345541對急性粒細(xì)胞白血病(AML)細(xì)胞DNA損傷修復(fù)的影響及其可能的作用機(jī)制。方法MTT法檢測VP-16作用于AML細(xì)胞，加入或不加入BMS-345541對該細(xì)胞增殖抑制的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測BMS-345541對AML細(xì)胞DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡的影響;高內(nèi)涵觀察不同處理組γ-H2AX、p-ATM、RAD51募集在斷裂位點(diǎn)的焦點(diǎn)情況。結(jié)果聯(lián)合用藥組比單用VP-16組對細(xì)胞的增殖抑制作用強(qiáng);流式檢測加入BMS-345541組比不加入組的γ-H2AX比例高，且加入BMS-345541組能夠抑制VP-16導(dǎo)致的AML細(xì)胞G2/M期阻滯，增加細(xì)胞的凋亡率;高內(nèi)涵檢測斷裂位點(diǎn)的p-ATM及RAD51的熒光焦點(diǎn)，6 h后，加入BMS-345541組比修復(fù)組的焦點(diǎn)的平均熒光強(qiáng)度和平均熒光面積高。結(jié)論VP-16導(dǎo)致AML細(xì)胞產(chǎn)生DNA損傷，加入BMS-345541，能通過抑制HR通路來抑制細(xì)胞DNA損傷修復(fù)。

關(guān)鍵詞:IKKβ; BMS-345541; DNA損傷;γ-H2AX; p-ATM; RAD51

當(dāng)前臨床治療腫瘤常用的放射治療及絕大多數(shù)抗腫瘤藥物的共同作用機(jī)制是損傷DNA。損傷DNA的分子機(jī)制不盡相同，常見的DNA損傷類型有單鏈斷裂(SSD)，雙鏈斷裂(DSB)，堿基損傷(base damage)，群集病變(clustered lesions)。主要可以通過以下6條修復(fù)通路予以修復(fù):同源重組(homologous recombination，HR)，非同源末端連接(non-homologous end-joining，NHEJ)，堿基切除修復(fù)(base excision repair，BER)，核苷酸切除修復(fù)(nucleotide excision repair，NER)，錯配修復(fù)(mismatch repair)和跨損傷修復(fù)(direct reversal)［1］。在DNA的損傷中，雙鏈斷裂是最嚴(yán)重的，主要通過HR和NHEJ進(jìn)行修復(fù)。DNA修復(fù)能力異常激活和增強(qiáng)是導(dǎo)致腫瘤對DNA損傷劑耐藥的重要分子基礎(chǔ);相反，修復(fù)缺陷則使腫瘤對其高度敏感。因此，尋找DNA修復(fù)抑制劑成為抗腫瘤研究領(lǐng)域的一項(xiàng)新熱點(diǎn)。

IKKβ是IKK復(fù)合體中的一個催化亞基，通過經(jīng)典途徑激活核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)，在免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用［2］。經(jīng)典的IKK/NF-κB的激活途徑是: IKK磷酸化IκBα，磷酸化的IκBα被泛素化降解，釋放游離的p65，與p50結(jié)合形成p65-p50的二聚體進(jìn)入核內(nèi)，結(jié)合到DNA的κB序列，啟動下游的基因轉(zhuǎn)錄，介導(dǎo)細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、抗凋亡。最近的有研究表明:在乳腺癌、胃癌和宮頸癌細(xì)胞中，IKKβ與DNA雙鏈損傷修復(fù)密切相關(guān)，且是非依賴于經(jīng)典的IKKβ/NF-κB途徑［3－4］。隨后又證實(shí)抑制IKKβ可通過抑制HR修復(fù)來抑制乳腺癌細(xì)胞的DNA雙鏈斷裂修復(fù)［5］。

本課題使用的依托泊苷(VP-16)是鬼臼毒素的半合成衍生物，可誘導(dǎo)白血病細(xì)胞產(chǎn)生DNA雙鏈損傷，臨床上廣泛用于治療急性粒細(xì)胞白血病(AML)等惡性腫瘤。BMS-345541是IKKβ的新型選擇性抑制劑［6］。研究顯示，BMS-345541在體外和體內(nèi)模型中，均可有效地抑制IKKβ活性，減少NF-κB及其調(diào)節(jié)的炎癥因子的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)旨在探討VP-16導(dǎo)致AML細(xì)胞產(chǎn)生DNA損傷后，用BMS-345541抑制IKKβ能否抑制細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)進(jìn)而增敏VP-16對AML的療效。

1　材料與方法

1.1材料BMS-345541購于美國Selleck Chemicals公司，溶解于ddH2O中，配成儲存液20 mmol· L－1于－20℃?zhèn)溆?，使用前解凍，用培養(yǎng)液稀釋成所需濃度。VP-16注射液購于齊魯制藥有限公司，濃度為34 mmol·L－1，使用前用培養(yǎng)液稀釋成所需濃度。Hyclone RPMI1640培養(yǎng)基和Hyclone胎牛血清均購于Thermo Scientific。MTT［3-(4，5-二甲基噻唑-2) -2，5-二苯基四氮唑溴鹽］購置于美國Sigma公司，用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋成5 g·L－1存儲液，小劑量分裝，－20℃避光儲存。γ-H2AX單克隆抗體購置于Cell Signaling Technology公司，p-ATM，RAD51單克隆抗體均購置于Abcam公司，羊抗兔IgG-HRP二抗購于凱基生物公司。DNA損傷試劑盒購于BD公司。流式凋亡檢測試劑盒均購自瑞士Roche公司。RNA酶和碘化丙啶(PI)購于美國Sigma公司。酶標(biāo)儀Microplate Reader 450購于美國BIO-RAD公司; BD FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀購于BD公司;高內(nèi)涵購于Thermo Fisher公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)HL-60細(xì)胞和KG1a細(xì)胞采用含0.1的胎牛血清RPMI 1640，青霉素(100 000 IU ·L－1)和鏈霉素(50 mg·L－1)，在37℃、5 %的CO2孵育箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組與處理實(shí)驗(yàn)分組如下:對照組: RPMI 1640培養(yǎng)基;損傷組: VP-16處理2 h;修復(fù)組: VP-16處理細(xì)胞2 h后洗掉藥物繼續(xù)培養(yǎng)6 h;聯(lián)合用藥組: VP-16處理2 h后洗掉藥物加入BMS-345541繼續(xù)培養(yǎng)6 h; BMS組: BMS-345541處理組(6 h)。

1.2.3MTT法檢測藥物對細(xì)胞的增殖抑制作用

取對數(shù)生長期的白血病細(xì)胞HL-60和KG1a，按5× 107·L－1接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔180 μL。實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度的藥物20 μL，對照組不加藥物，另設(shè)背景對照，每組設(shè)3個平行孔，37℃培養(yǎng)24 h。加入5 g·L－1的MTT溶液，每孔20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，離心棄上清，加入150 μL DMSO，微量振蕩儀振蕩10 min，立即用酶標(biāo)儀在570 nm波長處測吸光度(OD值)。根據(jù)吸光度計(jì)算細(xì)胞生長抑制率［細(xì)胞生長抑制率/%=(對照組OD－實(shí)驗(yàn)組OD)/對照組OD×100%］。以藥物濃度為橫軸，抑制率值為縱軸繪制細(xì)胞增殖抑制量效關(guān)系曲線。

1.2.4流式檢測細(xì)胞DNA損傷的情況取對數(shù)生長期HL-60細(xì)胞，按分組要求用藥物處理后，收集細(xì)胞，以800 r·min－1離心5 min，棄上清，PBS洗滌，固定，破膜，DNase處理1 h，加入anti-H2AX熒光探針室溫孵育20 min(按DNA損傷試劑盒說明書操作)。轉(zhuǎn)入到流式管中，上機(jī)檢測。

1.2.5碘化丙啶染色法檢測細(xì)胞周期的步驟取對數(shù)生長期的HL-60細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞最終濃度為4×108·L－1，每孔2 mL，接種到6孔板中，按分組要求加藥處理后，收集細(xì)胞，800 r·min－1，離心5 min。用PBS洗滌細(xì)胞1次，收集細(xì)胞，用0.1 mL PBS重懸。取1 mL預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)為0.75的乙醇，將0.1 mL的細(xì)胞液緩慢地加入其中，輕輕混勻。4℃放置冷卻后，轉(zhuǎn)移到－20℃冰箱中放置24 h以上。待檢測時，離心棄去乙醇，用PBS洗滌1次，加入PI染色液(50 mg·L－1) 0.1 mL，加入RNA酶，使其終濃度為50 mg·L－1。室溫避光染色30 min后轉(zhuǎn)移入流式管中，4℃避光，冰上保存，并在流式細(xì)胞儀上檢測。

1.2.6Annxin-V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)步驟取對數(shù)生長期的HL-60細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞最終濃度為4×108·L－1，每孔2 mL，接種到6孔板中，按分組要求加藥處理后，收集細(xì)胞，800 r· min－1，離心5 min。用PBS洗滌細(xì)胞兩次，收集細(xì)胞。加入500 mL的Binding Buffer重懸細(xì)胞。每組中加入5 μL的Annxin-V-FITC混勻后，再加入5 μL 的PI，混勻。室溫避光反應(yīng)15 min。轉(zhuǎn)移入流式管中，4℃避光，冰上保存，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.7高內(nèi)涵檢測γ-H2AX、p-ATM、RAD51在斷裂位點(diǎn)的聚集情況取對數(shù)生長期的HL-60細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞最終濃度為4×108·L－1，每孔8 mL，接種到大培養(yǎng)皿中，加藥處理后，收集細(xì)胞，800 r·min－1，離心5 min。用PBS洗滌細(xì)胞兩次，收集細(xì)胞，固定，破膜，封閉，一抗孵育過夜，PBS洗滌3次，二抗避光孵育30 min，PBS洗滌3次，加DAPI避光孵育15 min，洗滌后用PBS重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×108·L－1，每孔0.1 mL，接種到96孔板中，平板離心機(jī)1 000 r·min－1，離心5 min。上機(jī)檢測。

2　結(jié)果

2.1聯(lián)合用藥組比單藥組對AML細(xì)胞的增殖抑制作用強(qiáng)單藥組:用不同濃度的VP-16處理HL-60和KG1a細(xì)胞;聯(lián)合用藥組:用VP-16處理細(xì)胞2 h后洗掉藥物，再加入不同濃度的BMS-345541。24 h后，MTT法檢測，結(jié)果采用GraphPad Prism 5軟件分析，可以明顯看出聯(lián)合用藥組的抑制率比單藥組的抑制率高(Fig 1)。

Fig 1 Proliferation inhibition of HL-60 and KG1a with BMS-345541 and VP-16 treatments

2.2AML細(xì)胞產(chǎn)生DNA損傷后，BMS-345541可抑制其DNA損傷修復(fù)H2AX的磷酸化是DSBs發(fā)生后最早期的事件之一，損傷發(fā)生后幾分鐘，細(xì)胞核內(nèi)就能檢測到散在的γ-H2AX。目前，γ-H2AX的水平已經(jīng)成為公認(rèn)的DSBs發(fā)生早期的標(biāo)志［7］。不同處理組處理HL-60細(xì)胞，流式檢測γ-H2AX的比例(Fig 2)，高內(nèi)涵檢測各組γ-H2AX焦點(diǎn)的平均熒光面積和平均熒光強(qiáng)度(Fig 3)。對比高內(nèi)涵和流式結(jié)果可知，對照組γ-H2AX的比例極少，VP-16處理細(xì)胞2 h的損傷組含量最多，而修復(fù)6 h后，其比例下降，DNA損傷減少，聯(lián)合用藥組γ-H2AX的含量比修復(fù)組高，且差異有顯著性(P＜0.01)。提示: AML細(xì)胞產(chǎn)生DNA損傷后，BMS-345541可抑制其DNA損傷修復(fù)。

Fig 2 FCM tested effect of BMS-345541 onrepair of DNA DSBs in AML cells

2.3BMS-345541抑制DNA損傷修復(fù)與p-ATM的關(guān)系用高內(nèi)涵檢測斷裂位點(diǎn)p-ATM的焦點(diǎn)情況，由高內(nèi)涵所得數(shù)據(jù)可知(Fig 4) :聯(lián)合用藥組的p-ATM焦點(diǎn)的平均熒光面積和平均熒光強(qiáng)度比修復(fù)組高(P＜0.01) ;由高內(nèi)涵所得圖片可知:聯(lián)合用藥組的紅色熒光(p-ATM)比修復(fù)組高(P＜0.01)。說明: VP-16作用于AML細(xì)胞后產(chǎn)生DNA損傷，BMS-345541抑制其DNA損傷修復(fù)可使斷裂位點(diǎn)p-ATM焦點(diǎn)增多，使其停留在DNA損傷應(yīng)答階段。

2.4AML細(xì)胞產(chǎn)生DNA損傷后，BMS-345541抑制細(xì)胞G2/M期阻滯，增加細(xì)胞凋亡不同組處理HL-60細(xì)胞，PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期，結(jié)果顯示: VP-16作用于AML細(xì)胞后會導(dǎo)致其產(chǎn)生G2/M期阻滯，加入BMS-345541后，隨著其藥物濃度的增加，G2/M期阻滯逐漸變?nèi)?。且呈劑量依賴性關(guān)系。PI和Annexin V-FITC雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，結(jié)果提示:聯(lián)合用藥組與VP-16組比凋亡率高(P＜0.05)。

2.5BMS-345541抑制DNA損傷修復(fù)與RAD51的關(guān)系同源重組修復(fù)是最重要的修復(fù)機(jī)制之一，主要在S期和G2后期被激活［8］。而RAD51是同源重組修復(fù)的中心分子，主要催化斷裂的DNA雙鏈與完整的同源DNA姐妹鏈進(jìn)行鏈間轉(zhuǎn)移置換［9］。當(dāng)DNA出現(xiàn)雙鏈斷裂時，RAD51蛋白的表達(dá)增高，并在斷裂位點(diǎn)募集形成多個核灶區(qū)。用高內(nèi)涵檢測斷裂位點(diǎn)RAD51的焦點(diǎn)情況，由各組焦點(diǎn)的平均熒光面積和平均熒光強(qiáng)度可知(Fig 6) :聯(lián)合用藥組的RAD51焦點(diǎn)比修復(fù)組多(P＜0.01)。說明: AML細(xì)胞產(chǎn)生DNA損傷后，加入BMS-345541組，RAD51焦點(diǎn)在斷裂位點(diǎn)的聚集未能散去而持續(xù)存在，說明細(xì)胞停留在DNA損傷應(yīng)答階段，HR通路被抑制，從而抑制細(xì)胞DNA損傷修復(fù)。

Fig 3 HCA tested the effect of BMS-345541 on repair of DNA DSBs in AML cells

Fig 4 Relationship between p-ATM and BMS-345541 inhibited repair of DNA DSBs

Fig 5 BMS-345541 inhibite?d cell cycle G2/M phase arrest and increased apoptosis ratio

Fig 6 Relationship between RAD51 and BMS-345541 inhibited the repair of DNA DSBs

3　討論

AML是一類造血干細(xì)胞異常的克隆性惡性疾病，其克隆中的白血病細(xì)胞失去進(jìn)一步分化成熟的能力而停滯在細(xì)胞發(fā)育的不同階段。白血病細(xì)胞在骨髓和其他造血組織中大量增生、積聚，并浸潤其他器官和組織，同時使正常造血受到抑制，臨床表現(xiàn)為出血、貧血、感染及各器官浸潤癥狀。其臨床治療，仍然采用傳統(tǒng)的細(xì)胞毒藥物，大部分在接受化療后病情會緩解，但停藥后易復(fù)發(fā)。而DNA修復(fù)能力的異常激活和增強(qiáng)是導(dǎo)致腫瘤對DNA損傷劑耐藥的重要分子基礎(chǔ)，所以，尋找DNA損傷修復(fù)抑制劑成為抗腫瘤研究領(lǐng)域的一項(xiàng)新的熱點(diǎn)。

本研究發(fā)現(xiàn)，VP-16導(dǎo)致AML細(xì)胞產(chǎn)生DNA損傷，若不加入BMS-345541，則細(xì)胞將進(jìn)行自我修復(fù)，6 h后γ-H2AX、p-ATM、RAD51在斷裂位點(diǎn)的焦點(diǎn)逐漸散去，修復(fù)基本完成;而加入BMS-345541抑制IKKβ后，斷裂位點(diǎn)的γ-H2AX、p-ATM、RAD51焦點(diǎn)持續(xù)存在，與修復(fù)組比差異有顯著性，說明DNA損傷修復(fù)被抑制。

ATM作為DNA損傷信號傳導(dǎo)通路中最早的傳感和中樞調(diào)控基因，當(dāng)DNA損傷時，信號傳導(dǎo)通路中的上游基因ATM能夠感受DNA損傷信號，在每個斷裂部位產(chǎn)生大量的p-ATM。DNA損傷修復(fù)分為兩部分: DNA損傷應(yīng)答和DNA損傷修復(fù)。當(dāng)聯(lián)合用藥組p-ATM在斷裂位點(diǎn)的焦點(diǎn)增多說明DNA損傷信號持續(xù)高表達(dá)，處于DNA損傷應(yīng)答階段，DNA損傷未被修復(fù)。同源重組修復(fù)是DNA雙鏈損傷的主要修復(fù)方式，對于保持哺乳動物細(xì)胞的基因組完整性十分重要［10］。已有研究指出，與正常的細(xì)胞相比較，腫瘤細(xì)胞可以優(yōu)先依賴HR通路修復(fù)DNA雙鏈斷裂［11］。RAD51是HR的中心分子，它參與DNA損傷感應(yīng)和細(xì)胞周期關(guān)卡的復(fù)雜信號通路。若細(xì)胞完成修復(fù)(如修復(fù)組)，RAD51在斷裂位點(diǎn)的聚集將解散，而持續(xù)存在則說明細(xì)胞始終停留在DNA損傷的應(yīng)答階段，未進(jìn)行DNA損傷修復(fù)。HR通路被抑制。

細(xì)胞在遭受DNA損傷時，會激活DNA損傷應(yīng)答反應(yīng)，如使損傷細(xì)胞周期發(fā)生阻滯為細(xì)胞啟動DNA損傷修復(fù)提供時間。從本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，VP-16作用于AML細(xì)胞產(chǎn)生DNA損傷后，周期阻滯在G2/M期，而當(dāng)加入IKKβ抑制劑BMS-345541后，隨著藥物濃度的增加，G2/M期的阻滯逐漸被抑制，從而使損傷細(xì)胞沒有足夠的時間進(jìn)行DNA損傷修復(fù)。然而，HR修復(fù)主要在S期和G2后期被激活，G2/M期阻滯抑制也使HR修復(fù)不能被激活。流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡也顯示IKKβ抑制后，能增加VP-16對AML的敏感性，使其凋亡率增高。

4　結(jié)論

VP-16導(dǎo)致AML細(xì)胞產(chǎn)生DNA損傷后，加入BMS-345541，通過抑制HR通路抑制細(xì)胞DNA損傷修復(fù)。

(致謝:本實(shí)驗(yàn)在福建省天然藥物藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、福建醫(yī)科大學(xué)新藥研究所完成。)

參考文獻(xiàn):

［1］Aziz K，Nowsheen S，Pantelias G，et al.Targeting DNA damage and repair: embracing the pharmacological era for successful cancer therapy［J］.Pharmacol Ther，133(3) : 334－50.

［2］王曉璐，方玉春，李靜.IKKβ結(jié)構(gòu)與功能及其抑制劑研究進(jìn)展［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2012，28(2) :158－61.

［2］Wang X，F(xiàn)ang Y，Li J.On structure and functions of IκB kinaseβ and development of its inhibitors［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28(2) :158－61.

［3］Wu L，Shao L，An N，et al.IKKb Regulates the repair of DNA double-strand breaks induced by ionizing radiation in MCF-7 breast cancer cells［J］.PLoS ONE，2011，6(4) : e18447.

［4］Sakamoto K，Hikiba Y，Nakagawa H，et al.Promotion of DNA repair by nuclear IKKb phosphorylationof ATM in response to genotoxic stimuli［J］.Oncogene，(2013) 32，1854－62.

［5］Wu L，Shao L，Li M，et al.BMS-345541 sensitizes MCF-7 breast cancer cells to ionizing radiation by selective inhibition of homologous recombinational repair of DNA double-strand breaks［J］.Radiat Res，2013，179(2) :160－70.

［6］Burke J R，Pattoli M A，Gregor K R，et al.BMS-345541 is a highly selective inhibitor of I kappa B kinase that binds at an allosteric site of the enzyme and blocks NF-kappa B-dependent transcription in mice［J］.J Biol Chem，2003，278:1450－6.

［7］Zhang T，Tan Y，Zhao R，Liu Z.DNA damage induced by oridonin involves cell cycle arrest at G2/M phase in human MCF-7 cells ［J］.Wspolczesna Onkol，2013，17(38－44) :10.5114.

［8］Rothkamm K，Kruger I，Thompson L H，Lobrich M.Pathways of DNA double-strand break repair during the mammalian cell cycle ［J］.Mol Cell Biol，2003，23:5706－15.

［9］彭亞婷，梅金紅.RAD51與腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展［J］.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2011，27(1) :86－9.

［9］Peng Y T，Mei J H.Advances of the relationship between RAD51 and cancer research［J］.Chin J Clin Exp Pathol，2011，27(1) :86 －9.

［10］Valerie K，Povirk L F.Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair［J］.Oncogene，2003，22:5792－812.

［11］Yang J，Amiri K I，Burke J R，et al.BMS-345541 targets inhibitor of kappaB kinase and induces apoptosis in melanoma: involvement of nuclear factor kappaB and mitochondria pathways［J］.Clin Cancer Res，2006，12:950－60.

BMS-345541 regulates repair of DNA double-strand breaks induced by VP-16 in acute myeloid leukemia cells

TIAN Jue1，2，3，CHEN Xian-ling4，5，ZHUANG Ying-ting1，2，3，F(xiàn)AN Ying-juan1，2，3，XU Jian-hua1，2，3，WU Li-xian1，2，3
(1.Dept of Pharmacology，F(xiàn)ujian Medical University，F(xiàn)uzhou 350004，China; 2.Key Laboratory of Natural Drug Pharmacology in Fujian Province，F(xiàn)uzhou 350004，China; 3.Institute of Material Medica，F(xiàn)ujian Medical University，F(xiàn)uzhou 350004，China;4.Dept of Hematology，F(xiàn)ujian Medical University Union Hospital，F(xiàn)uzhou 350001，China;5.Institute of Hematology in Fujian Province，F(xiàn)uzhou 350001，China)

Abstract:AimTo investigate the effect of BMS-345541 on the repair of DNA DSBs induced by VP-16 in AML cells and its possible mechanism.Methods The effects of BMS-345541 on the sensitivity of AML cells to VP-16 were determined by MTT.Flow cytometry (FCM) was applied to test the level of DNA damage，cell cycle progression and apoptosis in AML cells.High content analysis (HCA) was used to verify the amount of γ-H2AX，p-ATM，RAD51 in AML cells.ResultsBMS-345541 could significantly inhibit the proliferation of AML cells induced by VP-16.BMS-345541increased the amount of RAD51 foci and p-ATM foci in AML cells treated with VP-16 after 6 hours，which led to increased numbers of cells in the G2/M phases of the cell cycle，then induced apoptotic cell death.Conclusion BMS-345541 sensitizes AML cells to VP-16 via selective inhibition of homologous recombinational repair of DNA double-strand breaks.

Key words:IKKβ; BMS-345541; DNA damage;γ-H2AX; p-ATM; RAD51

作者簡介:田崛(1990－)，女，碩士生，研究方向:腫瘤藥理學(xué)，E-mail: amyjue628@163.com;陳顯凌(1980－)，男，博士，主治醫(yī)師，研究方向:血液學(xué)，共同第一作者，E-mail:315561399@ qq.com;吳麗賢(1975－)，女，博士，副教授，博士生導(dǎo)師，研究方向:腫瘤藥理學(xué)，通訊作者，E-mail: 18259000966 @ 126.com

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 30901824，81173096，81273541) ;福建省自然科學(xué)基金杰出青年項(xiàng)目(No 2011J06013) ;福建省高?？缡兰o(jì)優(yōu)秀人才項(xiàng)目(No JA11101)

收稿日期:2015－01－30，修回日期:2015－03－10

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號:1001－1978(2015) 06－0763－07中國圖書分類號: R329.24; R329.25; R329.28; R342.3; R733.720.22

doi:10.3969/j.issn.1001－1978.2015.06.006