黃愉森 (深圳市龍崗區(qū)仁民動物醫(yī)院 廣東深圳518100)

鴨大腸桿菌病（Colibacillosis）是由某些致病血清型或條件致病性大腸埃希氏桿菌引起鴨的一種急性或慢性傳染病。該病以秋末春初多發(fā)，發(fā)病急，死亡快，主要侵害2～6周齡的雛鴨。易感染禽群可經污染的飼料飲水，通過消化道感染，此外呼吸道、種蛋等也具有很重要的傳播作用。新出殼的雛鴨發(fā)病后，體質軟弱，合眼縮頸，腹圍較大，常有腹瀉，多因敗血癥死亡。較大的雛鴨發(fā)病后，精神萎靡，食欲減退，隅立一旁，縮頸嗜眠，兩眼和鼻孔處常附黏性分泌物，有的病鴨排灰白色或綠色稀便，呼吸困難，常因敗血癥或體質衰竭，脫水死亡。不管是原發(fā)性或繼發(fā)性，其主要特征為發(fā)生心包炎、肝周炎、氣囊炎和輸卵管炎的病變。雛鴨的大腸桿菌剖檢主要變化可見有心包膜、心內膜、肝被膜和氣囊膜表面有黃白色纖維性滲出物，有的腹膜可見到滲出性炎癥，肝臟多腫大，脾臟腫大發(fā)黑，剖開腹腔有腐敗氣味，有的雛鴨有臍炎病變。眼炎型的多見于1～2周齡的雛鴨；關節(jié)炎型的多見于7～10日齡的雛鴨；腦炎型多見于1周齡雛鴨；漿膜型的多見于2～6周齡雛鴨[1]。在臨床上可以單獨發(fā)生或者與其他疾病混雜在一起，造成較復雜的局面，對養(yǎng)禽業(yè)造成了較大的損失[2，3，4]。國內在1982年由郭予強[5]最先報道廣東省2個大型鴨場的2～6周齡的雛鴨發(fā)生大腸桿菌敗血癥；李冰[6]2001年報道黑龍江省肇州縣某鴨場飼養(yǎng)的1 500只5日齡雛鴨陸續(xù)發(fā)病，發(fā)病率達34.2%，死亡率達20%；2005年，江蘇省寶應縣某養(yǎng)鴨場雛鴨暴發(fā)大腸桿菌病，發(fā)病率40%，死亡率為21%[7]?？梢?，隨著養(yǎng)鴨業(yè)的不斷發(fā)展，大腸桿菌病已成為影響?zhàn)B鴨生產效益的重要疾病之一。

綜合國內外研究情況，目前對于該病的病原生物學特性、病型、臨床癥狀和剖檢變化等方面進行了較多的研究，而對本病的病理學動態(tài)變化進行全面系統(tǒng)的觀察國內尚較少見報道。鑒于全面系統(tǒng)地研究白鴨大腸桿菌的病理學動態(tài)變化，以探討該病菌感染鴨的發(fā)病機理，可為有效防治該病提供理論依據，故本試驗對白鴨感染大腸桿菌后各時間段的全身器官組織的病理學變化進行了較為詳細的探討。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株

鴨源大腸桿菌O28株，由佛山科學技術學院畜牧獸醫(yī)研究所提供。

1.1.2 試驗動物

1日齡仙湖肉鴨，購自佛山科學技術學院科研禽場。

1.1.3 培養(yǎng)基

麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和普通瓊脂培養(yǎng)基,均按常規(guī)方法配制。

1.1.4 主要試劑

10%福爾馬林溶液、各種濃度酒精、二甲苯、石蠟、蘇木素伊紅染色液、中性樹膠等。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗動物分組與接種

將100只15日齡健康雛鴨隨機分為2組：試驗組70只，經肌肉注射大腸桿菌O28株24h液體培養(yǎng)物，0.5mL/只。對照組30只，經肌肉注射滅菌營養(yǎng)肉湯，0.5mL/只。試驗組和對照組在外界條件相同的情況下，隔離飼養(yǎng)。

1.2.2 臨床觀察與試驗組織材料的采取

在試驗鴨接菌后32h、40h、48h、56h和64h的各時間點分別觀察試驗雛鴨1次，記錄出現(xiàn)的臨床癥狀，對死亡和瀕臨死亡的雛鴨進行剖檢，觀察病理變化。并在上述各時間段隨機從試驗組及對照組各取2只，撲殺后采取心、肝、脾、肺、腎、胰、腦、胸腺、盲腸扁桃體、法氏囊和哈德氏腺等器官組織，用10%福爾馬林溶液固定，制成石蠟切片，采用HE染色方法，光學顯微鏡觀察各器官的病理動態(tài)學變化。

1.2.3 感染鴨細菌的分離與鑒定

無菌操作采取感染雛鴨心血、肝和腦組織進行細菌分離培養(yǎng)和生化鑒定。

1.2.4 組織切片的制備

1.2.4.1 固定將上述所采取的新鮮組織塊放入10%福爾馬林固定液中，固定12～36h。

1.2.4.2 脫水、透明

脫水之前進行水洗，充分水洗除去固定液，以免影響染色，經固定的組織內因多量的水分較柔軟，不易切成薄片，須讓石蠟透入組織，因蠟冷凝后即成硬塊，便于薄切，但石蠟不能與水相混。因此，在浸蠟包埋前須將其中水分完全除去。

常用的脫水劑是酒精，因酒精有脆化組織使組織強度收縮的作用，為減少組織收縮，應先從低濃度開始，然后遞增濃度，直至無水酒精。水洗后的組織，經修整成組織塊裝入脫水盒里并放入70%酒精中進行脫水，然后將組織塊移入85%酒精—98%酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）—100%酒精（Ⅰ）、（Ⅱ），在各級濃度酒精中各置2h。

1.2.4.3 浸蠟與包埋

浸蠟即將已透明的材料移入熔化的石蠟內，其目的是去除組織中的透明劑，而使石蠟滲入組織中。先將透明的組織塊移入二甲苯與石蠟各半的混合液中，在60℃恒溫箱中放置10～15min，然后移入熔化的石蠟（Ⅰ）、（Ⅱ）每級各置1～2h，置于恒溫箱中。然后將包埋用的金屬包埋框置于平臺上，倒入已熔化的石蠟，隨即從石蠟（Ⅱ）中取出組織塊，切面朝下，放于框的正中，貼上標簽，待石蠟凝結后，拆去包埋框，即成石蠟塊。

1.2.4.4 切片

切片前，先將蠟塊修整成正方形或長方形，然后將蠟塊貼在一小木塊上，貼上標簽后，將蠟塊裝在切片機上，切成5～7μm的薄片，切下的薄片連成蠟帶，用毛筆輕輕取下蠟帶，裝在盒內。

1.2.4.5 展片與粘片

將切下的組織薄片放入攤片機內，將其浮在水面上自然展開，水溫保持40℃左右，用鑷子將完整的組織片分離開來，然后將經酒精浸泡的蓋玻片用鑷子夾起，撈出組織片，傾去水分，將其放于切片盒上，放入37℃左右恒溫箱經12h烤干。

1.2.4.6 HE染色與固定

組織材料切成薄片后，多為無色，必須經各種染色，方可在顯微鏡下鑒別各種組織的微細結構。含有石蠟的組織片不能被水溶性染料染色。因此，染色前必須先用二甲苯將石蠟脫掉，然后經95%、85%和70%各級酒精，使組織逐步接近于水，最后用蒸餾水洗去酒精，即可染色。（1）脫蠟：首先將切片放入二甲苯（Ⅰ）—二甲苯（Ⅱ）中，各置5min，以溶去切片的石蠟。然后將脫蠟的切片經各級濃度酒精逐漸下行至水，即將切片從二甲苯（Ⅱ）中取出移入95%酒精—80%酒精—70%酒精—50%酒精，各級中停留2min，最后放入蒸餾水中。（2）染色：細胞核染色：將切片從水中移入HANSEN蘇木素染液中染8min，待胞核呈紫藍色。用水洗去切片上殘余的染液5min，然后用鹽酸酒精分色數秒鐘。再將切片放入蒸餾水中15～20min，加以藍化。細胞質染色：用0.5%伊紅染液1～2min至胞質呈粉紅色。

1.2.4.7 脫水

依次放入80%酒精—95%酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）—100%酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各置2min，以去除切片上的水分。

1.2.4.8 透明

切片放入二甲苯（Ⅰ）、（Ⅱ）各置5min。

1.2.4.9 封片

將浸潤在酒精中的載玻片取出，用凈紗布擦干凈，貼上標簽，然后在載玻片中適當位置滴1滴中性膠干燥。

1.2.5 切片觀察

使用光學顯微鏡觀察各切片的細微病理組織結構，并根據不同時間段做好記錄，備用。

2 試驗結果

2.1 臨床癥狀和大體病理變化

細菌接種后32h，可見部分鴨只開始出現(xiàn)精神沉郁（圖1），食欲減退。接種后40～48h，試驗鴨下痢，出現(xiàn)呼吸困難。死亡鴨剖檢病理表現(xiàn)為：①心包積液、混濁，心包膜表面被覆淡黃色的纖維素性滲出物，心包不透明。②腹腔有滲出液,淡黃色。③肝臟：腫大,實質較脆，呈土黃色或紅褐色，表面覆蓋有一層灰白色或灰黃色纖維素性膜狀物，容易剝離；膽囊腫大，膽汁黏稠，呈黃褐色。④氣囊：氣囊混濁增厚，表面覆蓋有灰白色或灰黃色纖維素性滲出物。⑤腸道：腸壁變薄,里面有大量液體，剪開腸壁流出的是黃綠色液體；腸道呈卡他性或壞死性炎癥。⑥腦:部分病死鴨腦膜出血、充血。接種后56～64h，試驗鴨可見不同程度的氣囊炎、肝周炎和心包炎等病變（圖2）。

2.2 感染細菌分離結果

從試驗感染雛鴨心血、肝和腦組織均分離到細菌，經培養(yǎng)、生化鑒定，其特性與接種菌株相同。

2.3 組織病理學動態(tài)變化

2.3.1 心

32h：心外膜增厚，其間有大量纖維素性滲出；心肌纖維變性，心肌纖維間可見多量紅細胞（圖3）。

40h：心肌纖維變性，結構比較紊亂，心肌纖維間出血。

48h：心肌纖維出現(xiàn)變性、萎縮，纖維間出血，血管擴張，充滿大量紅細胞和少量大腸桿菌（圖4）。

56h：心肌纖維變性，心肌纖維間有多量紅細胞。

64h：病變加深，心臟組織切片可見部分心肌細胞呈顆粒變性，在局部心肌細胞之間有炎性細胞浸潤。

2.3.2 肝

32h：肝包膜增厚，有纖維素性滲出物；肝細胞變性，肝血竇擴張，并有多量紅細胞，血管擴張，充滿紅細胞，血管周圍可見少量炎癥細胞（圖5）。

40h：肝細胞變性、壞死。細胞索結構紊亂，在血管周圍可見少量的炎癥細胞（肝細胞崩解、碎裂）。

48h：肝細胞變性、壞死，肝細胞竇和中央周圍堆積多量大腸桿菌、紅細胞和少量的炎癥細胞（血管擴張，充滿紅細胞）（圖6）。

56h：病變比較嚴重，肝細胞變性，壞死，細胞崩解、消失，血管周圍有少量炎癥細胞，血管擴張，充滿紅細胞和炎癥細胞（圖7）。

64h：肝細胞變性、壞死，肝血竇擴張，并有多量紅細胞。

2.3.3 肺

32h：肺泡壁增厚，毛細血管充血、出血，部分肺泡腔和細支氣管也充滿紅細胞和粉紅色的滲出物；（圖8）。

40h：肺泡壁毛細血管充血、出血，在肺泡腔里可見大量紅細胞聚集，在細支氣管周圍有多量炎癥細胞浸潤。

48h：細支氣管內外及肺泡腔等整個肺組織內充滿大量的炎性細胞和大腸桿菌；肺泡壁上充血、出血；肺泡結構模糊，細胞核濃縮，部分溶解，出現(xiàn)碎裂。

56～64h：肺間質明顯增寬，有多量紅細胞和炎癥細胞，血管擴張，充滿紅細胞；部分肺泡壁上皮細胞變性、壞死，留下淡染的細胞支架；部分肺泡腔充滿絲網狀的纖維素性滲出物（圖9，10，11）。

2.3.4 腎

32h：腎小管上皮細胞腫脹、脫落，腎間質出血；部分腎小球萎縮（圖12）。

40h：腎間質出血比較嚴重，腎小管上皮細胞崩解、脫落，腎小球萎縮。

48h：腎小管上皮細胞變性、壞死，腎間質出血，并有多量菌體（圖13）。

56～64h：腎小管上皮細胞與基底層脫離，腎小管上皮細胞核濃縮，部分上皮細胞崩解、脫落，腎小管結構模糊，腎間質出血。

2.3.5 脾

32～40h：紅髓堆積多量紅細胞，白髓淋巴細胞變性、壞死，數量減少，形成壞死灶。

48h：病變比較嚴重，脾的紅髓和白髓淋巴細胞都出現(xiàn)變性、壞死和數量減少，形成大范圍的壞死灶，并可見多量菌體出現(xiàn)（圖14）。

56～64h：病變比較輕，紅髓堆積多量紅細胞，白髓淋巴細胞變性、壞死，形成局灶性壞死灶（圖15）。

2.3.6 腦

32h：腦血管及毛細血管間質增寬，神經元細胞結節(jié)狀，彌漫性增生，部分神經元細胞濃縮、變性和壞死（圖16）。

40h：腦組織結構比較疏松，可見少量大腸桿菌和紅細胞，血管周圍間隙明顯增寬。

48h：病變比較嚴重，神經膠質細胞呈彌散性或局灶性增生，血管周圍間隙明顯增寬，在實質里可見大腸桿菌，部分神經元變性，核濃縮（圖17）。

56～64h：病變比較輕，血管周圍間隙增寬，部分神經元細胞變性。

2.3.7 胰

32～40h：腺泡間質有少量紅細胞，腺泡上皮細胞變性、壞死，形成壞死灶（圖18）。

48h：腺上皮細胞嚴重變性、壞死，形成多個壞死灶，腺泡間質有多量炎性細胞浸潤，并有少量紅細胞和大腸桿菌（圖19）。

56～64h：腺泡上皮細胞變性、壞死，形成局灶性壞死，核濃染，腺泡間質出血（圖20，21）。

2.3.8 法氏囊

32～40h：未見明顯病理變化。48～56～64h：淋巴細胞結構的髓質和皮質的淋巴細胞減少（圖22，23）。

2.3.9 十二指腸

32～40h：小腸絨毛上皮細胞崩解、脫落。

48～56～64h：小腸絨毛上皮細胞崩解、脫落，固有層有多量的炎性細胞浸潤。

2.3.10 胸腺

32～40h：未見明顯病理變化。

48～64h：胸腺髓質區(qū)明顯增寬、出血、皮質變薄

（圖24）。

附圖

圖1患鴨精神沉郁

圖2 患鴨形成纖維素性心包炎、肝周炎和腹膜炎

圖3 心32h：有少量紅細胞浸潤，心肌間質增寬（水腫），心肌纖維斷裂、壞死（HE 400×）

圖4 心48h：心肌顆粒變性、斷裂和排列紊亂，心肌纖維間出血，并有少量菌體（HE 400×）

圖5 肝32h：肝細胞脂肪變性，血管周圍有炎性細胞浸潤（HE 400×）

圖6 肝48h：大量的大腸桿菌侵入肝索和肝血竇內（HE 400×）

圖7肝56h：肝細胞結構模糊，肝索結構紊亂、斷裂和溶解；肝細胞濃縮，出現(xiàn)肝細胞核碎裂（HE 400×）

圖8 肺32h：肺泡壁毛細血管充血、出血，部分肺泡腔充滿炎性滲出物和紅細胞（HE400×）

圖9 肺48h：肺泡上皮細胞變性、壞死，肺泡腔內有多量菌體（HE 400×）

圖11 肺56h：廣泛性出血，肺泡結構模糊，細胞核濃縮，部分溶解，出現(xiàn)核碎裂（HE 400×）

圖10 肺56h：肺泡壁毛細血管充血、出血（HE 400×）

圖12 腎32h：淀粉樣物質呈均質紅染的塊狀或條索狀，存在于竇狀隙內皮和肝細胞索之間（HE 400×）

圖13 腎48h：腎小管之間有大量紅細胞浸潤，腎小管上皮細胞與基底層脫離，腎小管上皮細胞核濃縮，部分上皮細胞崩解、脫落，腎小管結構模糊（HE 400×）

圖14 脾32h：有大量的紅細胞浸潤，淋巴細胞數量減少，脾小體縮小，淋巴細胞變性、壞死（HE 400×）

圖15 脾48h：脾的紅髓和白髓淋巴細胞都出現(xiàn)變性、壞死和數量減少，形成大范圍的壞死灶，并可見多量菌體（HE 400×）

圖16 腦40h：腦血管及毛細血管間質增寬，可見少量紅細胞（HE 400×）

圖17 腦48h：神經元細胞結節(jié)狀，彌漫性增生，部分神經元細胞濃縮、變性和壞死（HE 400×）

圖18 胰40h：有多量的紅細胞（HE 400×）

圖19 胰48h：腺泡間質有少量紅細胞浸潤，有少量大腸桿菌浸入間質（HE 400×）

圖20 胰56h：胰島數量減少，部分腺泡出現(xiàn)變性、壞死（HE 400×）

圖21 胰64h：淀粉樣物質呈均質紅染的塊狀或條索狀，即腺泡淀粉樣變（HE 400×）

圖22 法氏囊48h：法氏囊濾泡的髓質內，淋巴細胞呈壞死、崩解，并出現(xiàn)大量異染性細胞、巨噬細胞和網狀細胞（HE 400×）

圖23 法氏囊56h：萎縮細胞內淋巴細胞多數消失，并為增生的網狀細胞所替代（HE 400×）

圖24 胸腺48h：胸腺髓質區(qū)明顯增寬、出血，皮質變薄，出現(xiàn)壞死灶（HE 400×）

2.3.11 哈德氏腺

32～40～48～56～64h：部分腺泡上皮細胞崩解、脫落，黏膜下層細血管充血、出血，有纖維素滲出。

2.3.12 盲腸扁桃體

32～40h：未見明顯病理變化。

48～56～64h：腸腺細胞、黏膜上皮細胞脫落、變性，少量出現(xiàn)壞死。

3 討論

3.1 鴨大腸桿菌研究的目的及意義

近年來,鴨大腸桿菌病在許多地區(qū)廣為流行,發(fā)病率和死亡率均較高。其危害性在某些地區(qū)甚至超過了常見的病毒性傳染病,成為當前危害我國養(yǎng)鴨業(yè)較為嚴重的細菌性傳染病之一。本試驗主要觀察各器官組織的病理動態(tài)學變化，探討該病菌感染鴨的發(fā)病機理，為有效地防治該病提供理論依據與實踐價值。

3.2 鴨大腸桿菌引起的臨床癥狀和病理變化特點

試驗選用目前在發(fā)病鴨群分離率較高的大腸桿菌O28對15日齡仙湖鴨進行人工致病，結果表明該菌株人工接種雛鴨具有強致病性，至接種后64h只有少數鴨存活。發(fā)病鴨形成明顯的纖維素性心包炎、肝周炎和腹膜炎，復制出與自然病例一樣的臨床癥狀和病理變化的病鴨。細菌侵入鴨體后，在呈現(xiàn)急性敗血癥過程的同時，主要以侵害肺、肝和腦等為特征。人工肌肉接種感染潛伏期約為32h，感染鴨的臨床癥狀主要表現(xiàn)為：細菌接種后32h，大部分鴨精神沉郁，食欲減退，部分鴨的肝、脾腫脹和瘀血；接種后40～48h，試驗鴨下痢，出現(xiàn)呼吸困難；接種后56～64h，試驗鴨可見不同程度的氣囊炎、肝周炎和心包炎等病變。病理變化主要特征為：雛鴨在感染大腸桿菌后32～64h，感染鴨的全身各器官組織的細胞均出現(xiàn)不同程度的變性、壞死和數量減少，有纖維素滲出，并在感染后48h可見病鴨的心、肝、肺和胰等有菌體聚集等病理特征。該病變特征與典型鴨大腸桿菌病一致[8]。

3.3 鴨大腸桿菌對機體各器官組織的損傷

試驗結果顯示，人工接種致病性大腸桿菌后主要損傷試驗鴨的心、肝、脾、肺、腎、胰和腦等器官組織，在攻毒后32h可見不同程度的損傷，至48h各器官組織損傷明顯，主要表現(xiàn)為組織細胞變性、壞死，細胞間質出血和炎癥細胞浸潤等組織病理學變化，并在組織中觀察到菌體。至攻毒后56～64h各器官組織病變逐漸減輕。另外，試驗鴨的法氏囊、胸腺和盲腸扁桃體等免疫器官組織損傷較輕，至攻毒后48h才出現(xiàn)較輕度的炎癥。

3.4 鴨大腸桿菌引起的各組織器官的病理損害對整個機體功能的影響

機體生命活動的維持有賴于機體內環(huán)境的動態(tài)平衡的相對穩(wěn)定。體液中氧和二氧化碳的濃度與營養(yǎng)物質及代謝產物的濃度、溫度等都必須維持相對的穩(wěn)定，而機體的各種活動都在維持這種相對的穩(wěn)定。若內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的變動超過一定限度，則必然對機體造成危害[9]，嚴重的甚至會造成機體的死亡。內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持決定于消化、呼吸、循環(huán)和排泄等系統(tǒng)的功能活動，但血液所引起的作用也是較重要的。總之，身體的各部分，以致構成身體的每一個細胞都以它自己的方式參與維護體內環(huán)境的穩(wěn)定[10]。而大腸桿菌侵害機體后引起各組織器官病變而導致各器官功能障礙，從而使機體的內環(huán)境失平衡，最終造成機體的死亡。

4 結論

（1）試驗菌株人工接種雛鴨具強致病性，潛伏期約為32h，發(fā)病死亡高峰集中在48～56h，患鴨出現(xiàn)特征的纖維素性心包炎、肝周炎和腹膜炎。

（2）試驗鴨攻毒后32h可見對心、肝、脾、肺、腎、胰和腦等器官組織的損傷，至48h損傷明顯，至56h后逐漸減輕。主要表現(xiàn)為組織細胞變性、壞死，細胞間質出血、纖維素性滲出和炎癥細胞浸潤等組織病理學變化。對免疫器官組織損傷較輕，攻毒后48h出現(xiàn)輕度炎癥。

[1]SaifYM ,BearnesHJ,Glisson,JR,etal.Diseasesof poultry[J].Ames：IowaStateUniversityPress,2003（11）,354-363.

[2]韓云,李蘭春.雛鴨曲霉菌與大腸桿菌混合感染的診治[J].中國獸醫(yī)雜志,2002,38（1）:57.

[3]樂濤,陳鳳,曾徐健,等.鴨疫里默氏桿菌和大腸桿菌合并感染的診斷[J].中國家禽,2006,28（1）:20-22.

[4]房寶志,李尚泉,孫明,等.鴨病毒性肝炎并發(fā)大腸桿菌病的診治[J].畜牧獸醫(yī)雜志,2003,22（6）:31.

[5]劉萍,胡世君,周秀富,等.雛鴨大腸桿菌病病原的分離及藥敏試驗[J].畜禽業(yè),2005,（10）:36-40.

[6]李冰,宜立峰,魏秋梅.雛鴨大腸桿菌病的診治[J].湖北畜牧獸醫(yī),2003,（1）:42.

[7]何寶恩,陳彬.雛鴨大腸桿菌病的診治[J].甘肅畜牧獸醫(yī),2006,36（1）:32-33.

[8]辛朝安主編.禽病學（第二版）[M].北京:中國農業(yè)出版社,2003，162-166.

[9]張玉生,傅偉龍主編.動物生理學[M].北京：中國科學技術出版社,1994,37:427-431.

[10]陳守良編著.動物生理學（第二版）[M].北京：北京大學出版社,1996,109-110.