范忠良 費(fèi) 磊 李 鍵 岳 華 張 斌* （四川省寶興縣農(nóng)業(yè)局 四川寶興縣 65700 西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 成都 6004）

鴨疫里默氏桿菌（Riemerellaanatipestifer，RA）屬黃桿菌科里默氏菌屬，為革蘭氏陰性、無運(yùn)動性、不形成芽孢的小桿菌，多呈單個(gè)、成雙，絲狀或鏈狀排列，瑞氏染色時(shí)大部分細(xì)菌呈兩極著色特性。鴨疫里默氏桿菌病是由鴨疫里默氏桿菌引起的一種接觸性傳染性疾病，又稱為鴨傳染性漿膜炎。多見于1～8周齡的小鴨，尤以2～3周齡雛鴨較易感。在臨床上以下痢、共濟(jì)失調(diào)和眼鼻有分泌物為特征，病變見有纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、胸膜炎或干酪性輸卵管炎為特征[1-3]。鴨疫里默氏桿菌病是嚴(yán)重危害四川省養(yǎng)鴨業(yè)的重要細(xì)菌性疾病之一，流行廣泛，發(fā)病率為5%～90%，病死率達(dá)80%，給四川養(yǎng)鴨地區(qū)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床病例

四川省成都市某養(yǎng)殖戶送到西南民族大學(xué)禽病研究所就診的疑似鴨疫里默氏菌病病鴨，感染鴨為20日齡，病鴨主要臨床表現(xiàn)：精神沉郁，共濟(jì)失調(diào)，頭頸震顫，有的一側(cè)跗關(guān)節(jié)腫大，腿軟不愿走動或行動蹣跚，食欲下降；排出淡綠色稀便；眼鼻流出漿液性或黏液性分泌物，眼周圍羽毛黏連；鼻孔有漿液，凝結(jié)堵塞鼻孔，使患鴨呼吸困難；病鴨消瘦，死前有歪頭、抽搐、仰臥作劃水狀或角弓反張等神經(jīng)癥狀[4]。解剖病理變化：纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎以及肝腫、脾腫[5]。

1.1.2 試劑

TSA培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基均為杭州微生物有限公司產(chǎn)品；LB培養(yǎng)液為實(shí)驗(yàn)室自制；細(xì)菌微量生化鑒定管為杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品；PCR相關(guān)試劑為北京TIANGEN公司產(chǎn)品；其他化學(xué)試劑由本單位實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 設(shè)備

CO2培養(yǎng)箱（Thermoforma公司，美國）；高速離心機(jī)5804（Eppendorf公司，德國）；PCR儀my cyclerTM（Bio-Rad公司，美國）；核酸電泳儀 powerpacuniversalTM（Bio-Rad公司，美國）；凝膠成像系統(tǒng)VerSaDoc2000（Bio-Rad公司，美國）；核酸蛋白檢測儀DU800（Beckman公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)

無菌操作采集病鴨的腦、心血和肝臟病料，分別劃線接種至含5%馬血清的TSA培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基，置于37℃含5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48h，并觀察菌落形態(tài)。

1.2.2 染色鏡檢

培養(yǎng)后觀察細(xì)菌菌落特征，挑取疑似RA菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。

1.2.3 純培養(yǎng)和PCR鑒定

挑取單個(gè)菌落純化培養(yǎng)，用LB培養(yǎng)液增菌，分別取來源于腦、心血和肝臟的3個(gè)分離株的增菌液各1mL，用核酸蛋白檢測儀DU800測OD值。采用酚-氯仿抽提法提取DNA。

采用引物 (上游引物P1:5'-GTATTGAAAGCTCTGGCGG-3′和下游引物P2：5′-TCGCTTAGTCTCTGAACCC-3′），進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段長度為654bp。反應(yīng)體系25μL（10×PCR buffer 2.5μL， 2.5 mmol/L dNTP 0.5μL，25mmol/L MgCl21.5μL，10pmol/μL引 物 各1μL，5U/μLTaq酶0.2μL，DNA模板1 μL，滅菌去離子水補(bǔ)足25.0μL）。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5min；94℃30s、56℃30s、72℃1min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃8min。PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳分析。同時(shí)設(shè)RA參考菌株陽性和無模板對照（NTC）。

1.2.4 生化鑒定

用接種針將待檢測的RA在無菌的工作臺中接種于生化鑒定管中，置于37℃含5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48h，同時(shí)對待測菌株進(jìn)行氧化酶、接觸酶測定，觀察并記錄結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離結(jié)果

分離菌株在含5%馬血清的TSA培養(yǎng)基上，于37℃含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，為圓形、光滑濕潤、無色透明、直徑1～2mm的菌落形態(tài)，而在麥康凱培養(yǎng)基上不生長。

2.2 革蘭氏染色結(jié)果

革蘭氏染色鏡檢結(jié)果顯示分離菌株為革蘭氏陰性球桿狀細(xì)菌。

2.3 PCR鑒定結(jié)果

用根據(jù)鴨疫里默氏桿菌16S rDNA序列設(shè)計(jì)的引物經(jīng)PCR擴(kuò)增分離菌DNA模板，得到與預(yù)期目的片段大小一致的片段，該片段為654bp。3株分離株P(guān)CR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)其擴(kuò)增片段大小均與陽性對照一致，可確定該分離菌為RA。

2.4 生化鑒定結(jié)果

圖1 PCR鑒定結(jié)果M:makerDL2000；+:陽性對照；-:陰性對照；1,2和3：為分離的疑似鴨疫里默氏桿菌目的條帶

對該菌進(jìn)行了16項(xiàng)生化指標(biāo)檢測。3株菌株生化試驗(yàn)結(jié)果一致，均不能發(fā)酵多種碳水化合物，MR、VP試驗(yàn)陰性，不產(chǎn)生硫化氫，觸酶反應(yīng)為陽性。

3 結(jié)論

根據(jù)發(fā)病鴨的臨床癥狀和病例剖檢病變以及分離菌的菌落特征、形態(tài)、染色特征特性、生化特征及PCR擴(kuò)增結(jié)果確定該分離菌為RA，該鴨群暴發(fā)了鴨疫里默氏桿菌病。

[1]郭玉璞.我國對鴨傳染性漿膜炎研究概況 [J].中國獸醫(yī)雜志，1997，23(1)：37-38.

[2]施少華等.鴨疫里默氏菌病的研究進(jìn)展[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2005，26(8)：19-22.

[3]郭玉璞，陳德威，范國雄，等.北京鴨鴨傳染性漿膜炎的調(diào)查研究[J].畜 牧 獸 醫(yī) 學(xué) 報(bào)，1982，13(2)：107-112.

[4]張大丙，郭玉璞.鴨傳染性漿膜炎的流行病學(xué)調(diào)查[J].中國獸醫(yī)雜志，1999，25(12).

[5]張大丙，郭玉璞.北京地區(qū)鴨傳染性漿膜炎的流行病學(xué)調(diào)查[J].中國 預(yù) 防 獸 醫(yī) 學(xué) 報(bào)，1999，21(4)：260-263.