張蕾，劉敬禹，張輝

（1.遼寧醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，遼寧 錦州121000；2.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院 呼吸科，遼寧 錦州121000）

肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是一種原因不明，發(fā)病率和死亡率日趨增加的炎性間質(zhì)性肺部疾病。病理改變與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)，早期主要表現(xiàn)為彌漫性肺泡炎的炎癥性改變，晚期則為成纖維細(xì)胞大量增殖、細(xì)胞外基質(zhì)和膠原沉積增加、正常的肺組織被替代。其發(fā)病機制尚未完全明確，預(yù)后不良，臨床治療效果欠佳。

去整合素金屬蛋白酶17（disintegrin and metalloproteinase 17，ADAM17）屬于ADAMs家族成員之一，具有水解蛋白、使生物活性因子釋放的作用[1]，從而活化多種跨膜生長因子、細(xì)胞因子和受體[2-4]，參與黏附、遷移和信號傳遞等多種細(xì)胞過程[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，在人類腎臟細(xì)胞ADAM17通過促進TGF-α活化而發(fā)揮致纖維化的作用[5]。本文觀察了ADAM17在肺纖維化組織中ADAM17基因的表達，以及細(xì)胞外間質(zhì)Ⅲ型膠原蛋白、整合素6蛋白的表達，評價ADAM17在肺間質(zhì)纖維化疾病中的作用及分析可能的機制。

1 材料和方法

1.1 患者與肺組織

患者來自遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院呼吸內(nèi)、外科，病例收集時間為2008年4月-2011年4月。肺結(jié)節(jié)病16例，男8例，女8例，年齡33～54歲，均經(jīng)臨床特征、影像學(xué)、病理學(xué)活檢確診及證實，符合肺結(jié)節(jié)病診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；肺結(jié)核患者16例，男8例，女8例，年齡36～50歲，經(jīng)內(nèi)科胸腔鏡獲得病變組織，經(jīng)病理證實為肺結(jié)核。非小細(xì)胞肺癌10例，男5例，女5例，年齡40～70歲；志愿者8名，男4例，女4例，年齡35～52歲。作為正常對照，來源于胸外科手術(shù)切除肺部良性腫瘤周邊的正常肺組織，對照組患者均無吸煙史，胸片證實未見異常。以上均獲得遼寧醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 Realtime RT-PCR 首先進行cDNA第一鏈合成，從-80℃冰箱中取出RNA，在室溫下解凍，然后在0.2ml PCR管中配制反應(yīng)溶液：總RNA 3μg，Oligo-dT（1μg/μl）0.5μl，dNTP mix（10 mM）1μl，ddH2O（DEPC）7.5μl，將反應(yīng)管置于PCR儀中，65℃預(yù)變性5min。變性反應(yīng)結(jié)束后在PCR管中配制cDNA第一鏈合成反應(yīng)體系：5×first-strand bμffer 4.0μl，0.1MDTT 2.0μl，RNA inhibitor1.0μl，Superscript II（200U/μl）1.0μl，將PCR管子置于PCR儀中進行反應(yīng)，42℃保溫50min后，70℃變性15min。SYBR Green RT-PCR，反應(yīng)體系：2×SYBR Green PCR buffer 12.5μl，ROX 0.5μl，primer（5 pmol）1μl，Template+ddH2O 11μl。50℃孵育2min，然后95℃，2min；接著進行40個循環(huán)，94℃，30 s；62℃，30 s。

引物：ADAM17上游引物：5'-AGTCTGCCTGGC TCATCTTT-3'，下游：5'-TACATAATACCCGGGTCAC ACTC-3'；GAPDH上游引物：5'-TGACTTCAACAGC GACACCCA-3'，下游引物：5'-CACCCTGTTGCTGTA GCCAAA-3'。

1.2.2 W estern blot 將處理后的肺組織細(xì)胞用PBS洗2次，加入變性細(xì)胞裂解液并收集，煮沸5min，12 000 g離心15min，取上清液，-20℃保存?zhèn)溆?。BCA蛋白定量試劑盒測蛋白濃度，取20μg蛋白，進行SDS-PAGE，電壓120 V，電泳時間2 h；然后將蛋白印跡到硝酸纖維素膜上，于含5%脫脂奶粉的封閉液中室溫封閉2 h。一抗（1∶1 000）4℃過夜，二抗（1∶2 000）室溫孵育1 h，ECL發(fā)光試劑對硝酸纖維素膜進行顯色反應(yīng)，X膠片曝光，拍照。凝膠成像系統(tǒng)在白光下對X光膠片掃描后，進行吸光度分析，以肌動蛋白作為內(nèi)參，以與肌動蛋白的比值表示各組蛋白表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 去整合素金屬蛋白酶17基因在肺間質(zhì)纖維化組織中表達

ADAM17mRNA在肺結(jié)節(jié)病組、肺結(jié)核組、非小細(xì)胞肺癌中的表達水平均明顯高于正常對照組（P<0.05）；在肺結(jié)節(jié)病組與肺結(jié)核組的表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。肺癌組ADAM17 mRNA表達高于肺結(jié)節(jié)病組和肺結(jié)核組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見圖1。

2.2 Ⅲ型膠原蛋白、整合素6蛋白在肺間質(zhì)纖維化組織中表達

Ⅲ型膠原蛋白、整合素6蛋白在肺結(jié)節(jié)病組、肺結(jié)核組、非小細(xì)胞肺癌中的表達水平均明顯高于正常對照組（P<0.05）；在肺結(jié)節(jié)病組與肺結(jié)核組的表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。肺癌組Ⅲ型膠原蛋白、整合素6蛋白表達高于肺結(jié)節(jié)病組和肺結(jié)核組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

圖1 去整合素金屬蛋白酶17 mRNA在肺間質(zhì)纖維化組織表達Real-time PCR結(jié)果

圖2 Ⅲ型膠原蛋白、整合素6蛋白在肺間質(zhì)纖維化組織表達Western blot結(jié)果

3 討論

ADAM17參與多種炎癥和增生性疾病，其病理生理作用與腎纖維化、多囊腎和其他慢性腎臟疾病有關(guān)[6]。ADAM17與TGF-α 共同存在于腎纖維化中，MELENHORST等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在人類腎臟細(xì)胞ADAM17通過促進TGF-α 成熟而發(fā)揮致纖維化的作用。

在多種呼吸系統(tǒng)疾病包括COPD的氣道重塑中，基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）和金屬蛋白酶解離素（ADAMs）發(fā)揮著重要的作用[6]。吸煙已被證實減低金屬蛋白酶（TIMPs）內(nèi)生組織抑制劑的表達，激活A(yù)DAM17。目前的研究發(fā)現(xiàn)，ADAM17在腫瘤細(xì)胞表面被激活和呈高表達狀態(tài)[7]。在非小細(xì)胞肺癌中，通過ADAM17激活Notch 1導(dǎo)致EGFR表達增加[8]?？梢?，ADAM17與纖維化之間存在相關(guān)性。

本文以臨床肺間質(zhì)纖維化疾病（肺結(jié)節(jié)病、肺結(jié)核和非小細(xì)胞肺癌）組織作為研究對象，檢測了ADAM17mRNA及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白Ⅲ型膠原蛋白、整合素6蛋白表達情況，結(jié)果肺間質(zhì)纖維化疾病組織與正常肺組織對比，ADAM17及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白均表達加強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；尤其以肺癌組織表達最高，與正常對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），與肺結(jié)節(jié)病及肺結(jié)核組對照亦有統(tǒng)計學(xué)意義。分析ADAM17可能是導(dǎo)致肺纖維化的因素之一，機制如下：①ADAM17功能多樣，具有水解蛋白、使生物活性因子釋放的功能，可能導(dǎo)致組織增生、纖維化。研究表明：至少有74種不同的膜蛋白的修飾活化過程受ADAM17的調(diào)控[10]。而對于系統(tǒng)的TGF-α、HB-EGF、AR的活化則是必需的[11]；這些蛋白通過特異的信號傳導(dǎo)途徑，最終可能導(dǎo)致細(xì)胞的異常增殖，致纖維化；②ADAM17可能使細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間的作用減弱，破壞細(xì)胞與細(xì)胞基質(zhì)之間的平衡，最終形成肉芽腫，并為細(xì)胞外基質(zhì)沉積、肺纖維化的發(fā)生提供可能。本文得到的結(jié)果，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白表達增加即為纖維化機制之一；③在非小細(xì)胞肺癌中，ADAM17可激活Notch 1，導(dǎo)致一個EGFR表達增加的正反饋，從而使組織過度增殖，引起纖維化。

總之，肺纖維化疾病的組織ADAM17表達增高，伴隨細(xì)胞外基質(zhì)Ⅲ型膠原蛋白、整合素6蛋白表達同步增加，其作用機制可能是ADAM17打破了細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的表達平衡，導(dǎo)致基質(zhì)蛋白沉積。確切的機制有待進一步研究。

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