關(guān)麗娜，賀 瑩，韓 冰，孫雪飛，楊 帆

（1．軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點實驗室，陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院牙體牙髓病科，陜西西安710032；2．蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院口腔科，新疆烏魯木齊830000）

人炎癥及正常牙髓干細胞生物學(xué)特性的比較研究

關(guān)麗娜1，2，賀 瑩1，韓 冰1，孫雪飛1，楊 帆1

（1．軍事口腔醫(yī)學(xué)國家重點實驗室，陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院牙體牙髓病科，陜西西安710032；2．蘭州軍區(qū)烏魯木齊總醫(yī)院口腔科，新疆烏魯木齊830000）

目的：比較人炎癥及正常牙髓干細胞的（iDPSCs和DPSCs）的生物學(xué)特性。方法：體外培養(yǎng)純化、擴增iDPSCs和DPSCs分別檢測其細胞表面特異標記物的表達、細胞增殖率、克隆形成率；然后分別對兩種干細胞進行成骨、成脂誘導(dǎo)，并用RT－PCR檢測其成骨／成牙、成脂分化相關(guān)基因的表達。結(jié)果：炎癥和正常來源的DPSCs均陽性表達CD146、CD105、CD90和CD29，不表達CD45及CD31，兩種干細胞各表面標志物的表達無顯著性差異（P＞0．05），細胞增殖能力和單克隆形成數(shù)／率均無顯著差異（P＞0．05）。兩種干細胞經(jīng)礦化誘導(dǎo)后，茜素紅染色可見iDPSCs的礦化結(jié)節(jié)小于DPSCs，兩者的ALP活性亦無顯著性差異（P＞0．05）；成脂誘導(dǎo)后油紅－O染色均呈陽性反應(yīng)。RT－PCR檢測結(jié)果顯示，經(jīng)礦化誘導(dǎo)后均表達成骨相關(guān)基因RUNX2、OCN和成牙相關(guān)基因DSPP，但iDPSCs的RUNX2、OCN和DSPP的表達水平低于DPSCs（P＜0．05）；經(jīng)成脂誘導(dǎo)后兩種干細胞均表達成脂相關(guān)基因PPARγ，兩者的表達水平無顯著性差異（P＞0．05）。結(jié)論：炎癥DPSCs具有良好的增殖能力及多向分化潛能。

炎癥；DPSCs；細胞增殖；細胞分化

［Chinese Journal of Conservative Dentistry，2015，25（5）：288］

干細胞是人體的起源細胞，具有自我復(fù)制、高度增殖和多向分化的能力，按其來源可分為胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）和成體干細胞（adult stem cells，ASCs）［1］。ASCs存在于發(fā)育成熟的組織和器官內(nèi)，在特定條件下能夠按一定的程序分化，并形成新的功能細胞，從而使組織和器官保持生長和衰退的動態(tài)平衡。目前，已經(jīng)從多種組織或器官中分離獲得ASCs，如造血干細胞（hematopoietic stem cell，HSCs）、骨髓間充質(zhì)干細胞（mesenchymalstem cells，MSCs）、神經(jīng)干細胞（neural stem cells，NSCs）、肌肉干細胞（muscle stem cells）、成骨干細胞（osteogenic stem cells）等。

DPSCs（dental pulp stem cells，DPSCs）是從牙髓組織中分離獲得的一種具有自我更新、多向分化及免疫調(diào)節(jié)作用的ASCs［2－3］，是組織工程中極具潛力的種子細胞之一。但DPSCs的提取多采用拔牙后提取完整牙髓的方法，取材存在一定的局限性。自從Huang等［4］（2009）首次應(yīng)用口內(nèi)拔髓的方法成功分離DPSCs后，炎癥DPSCs（inflamed dental pulp stem cells，iDPSCs）因其材料來源廣泛、倫理學(xué)限制較少、可利用廢棄醫(yī)療資源等優(yōu)點越來越引人注目［5］。已有研究發(fā)現(xiàn)，iDPSCs具有向成骨／成牙本質(zhì)、成脂肪、成軟骨、成神經(jīng)等多向分化的潛力［4－8］。但目前對iDPSCs的研究尚處于起始階段，對其擴增能力和多向分化潛能仍存在爭議，臨床應(yīng)用前景仍需進一步的深入研究證實［9］。本實驗就iDPSCs的分離培養(yǎng)、增殖與分化能力等進行初步研究，并通過與DPSCs進行比較，以探討其臨床應(yīng)用的可行性。

1 材料和方法

1．1 主要試劑和儀器

超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備廠）；CO2培養(yǎng)箱（Heraeus，德國）；倒置顯微鏡及照相系統(tǒng)（Olympus，日本）；微孔板分光光度計（Bio－TEK，美國）；流式細胞儀（BD Bioscience，美國）；熒光定量PCR儀（Bio－rad，美國）；DMEM培養(yǎng)基和優(yōu)等胎牛血清（Gibico，美國）；青霉素和鏈霉素（華北制藥廠）；PE－CD146、PE－CD45、PE－CD34、PE－CD90、PE－CD29、PE－CD105（BioLegend，美國）；RNA提取試劑盒及實時聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）試劑盒（TAKARA，日本）。

1．2 牙髓組織樣本來源

炎癥牙髓組織3例，來自我科診斷為牙髓炎，且需進行牙髓治療的上頜前牙或前磨牙（年齡15～23歲）；正常牙髓組織3例，來自因正畸治療需要而拔除的健康前磨牙或第三磨牙（年齡13～22歲）。所有患者均排除家族遺傳病史、慢性感染性疾病史、全身系統(tǒng)性疾病、特殊藥物服用史及吸煙史；所有入選牙均排除有牙體、根尖周疾病及牙周病，且近期均未有急性感染。本研究經(jīng)我醫(yī)院倫理委員會批準，每位患者均知情同意書。

1．3 方法

1．3．1 iDPSCs和DPSCs的分離、培養(yǎng)

兩種牙髓干細胞的分離、培養(yǎng)均采用改良酶消化法。炎癥組牙髓的獲取采用口內(nèi)直接拔髓術(shù)，首先用洗必泰抗菌液漱口，并用聚維酮碘消毒根管口，然后以無菌拔髓針取牙髓組織；正常組牙髓從完整牙齒中劈開后獲得。所取牙髓組織立即轉(zhuǎn)移至超凈臺內(nèi)，用含有青、鏈霉素雙抗的0．1 mL／L PBS反復(fù)沖洗3～5次后，剪碎牙髓，并加入3 g／LⅠ型膠原酶和2．5 g／L胰蛋白酶各500μL，37℃水浴消化15 min。待組織塊呈絮狀時，加入含150 mL／L胎牛血清和青霉素、鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)液終止消化，并離心（1 000 r／min，10 min）棄上清；沉淀的細胞用DMEM培養(yǎng)液（含150 mL／L胎牛血清和青霉素、鏈霉素雙抗）重懸后接種于6孔板，并置于37℃、50mL／L CO2、飽和濕度條件下進行培養(yǎng)。每2～3 d更換1次培養(yǎng)液，待組織周邊有較多的細胞爬出后，挑棄組織塊繼續(xù)培養(yǎng)；當大多數(shù)克隆的細胞匯合至80%～90%時，采用有限稀釋法克隆分離DPSCs、iDPSCs并進行克隆培養(yǎng)和傳代擴增，取對數(shù)生長期的第3代和第4代細胞用于后續(xù)實驗。

1．3．2 DPSCs表面標志物的檢測鑒定

分別取生長狀態(tài)穩(wěn)定良好的DPSCs和iDPSCs，用預(yù)冷的PBS調(diào)整細胞密度為1×109／L后，分別用CD146、CD105、CD90、CD29、CD45和CD31標記抗體，并置于4℃下避光孵育30 min；然后用流式細胞儀檢測各表面標記物的表達。

1．3．3 MTT法檢測兩種干細胞的增殖能力

將生長狀態(tài)穩(wěn)定良好的iDPSCs和DPSCs，分別以2×103／孔的密度接種于96孔板，常規(guī)條件下培養(yǎng)24 h至細胞貼壁后，換液并繼續(xù)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)1、3、5、7、9 d各時間點，每種細胞各取3孔，并于每孔中各加入20μLMTT（5μg／mL）繼續(xù)培養(yǎng)4 h；然后棄去培養(yǎng)液，每孔加入150μL DMSO振蕩10 min，待結(jié)晶完全溶解后，用分光光度計分別測量各孔490 nm波長處的光密度值（OD490）。

1．3．4 兩種干細胞克隆形成率（CFU）的測定

將生長狀態(tài)穩(wěn)定良好的iDPSCs和DPSCs分別以0．5×103／孔的密度接種于6孔板，各復(fù)3孔，常規(guī)條件下培養(yǎng)至細胞克隆出現(xiàn)（約2周）后終止培養(yǎng)；吸棄原培養(yǎng)液，并加入甲醇固定15 min后，結(jié)晶紫染色15 min；PBS沖凈，空氣干燥后，計數(shù)≥50個細胞的克隆，并按以下公式計算兩種干細胞的克隆形成率?？寺⌒纬陕剩?）＝克隆數(shù)／接種細胞數(shù)（1×103）×100%。

1．3．5 礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)及茜素紅染色觀察

將生長狀態(tài)良好的iDPSCs和DPSCs分別以2．5×104／孔的密度接種于6孔板，常規(guī)條件下培養(yǎng)至細胞生長匯合達70%～80%時，更換礦化誘導(dǎo)液（含100 mL／L FBS、10 nmol／L地塞米松、10 mmol／Lβ－甘油磷酸鈉、50μg／mL維生素C的α－MEM培養(yǎng)基）進行礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)，每3 d換液1次。礦化誘導(dǎo)21 d后，茜素紅染色，光鏡觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況并拍照。

1．3．6 成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)及油紅O染色觀察

將生長狀態(tài)良好的iDPSCs和DPSCs分別以2．5×104／孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板，常規(guī)條件下培養(yǎng)至細胞生長匯合達70%～80%時，更換成脂誘導(dǎo)液（含 200μmol／mL吲哚美辛、0．5 mmol／mL IBMX、10μg／mL胰島素、1μmol／mL地塞米松、100 mL／L FBS的DMEM培養(yǎng)基）進行成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)，每3 d換液1次。成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)20 d后，油紅O染色，光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。

1．3．7 堿性磷酸酶（ALP）活性檢測

將生長狀態(tài)穩(wěn)定良好的iDPSCs和DPSCs分別以2×103個／孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板，常規(guī)培養(yǎng)24 h至細胞貼壁后換礦化誘導(dǎo)液繼續(xù)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)3、5、7 d各時間點，每種細胞各取3孔，吸棄上清并用PBS清洗2遍后，每孔加入50μL 2 mL／L Triton－100繼續(xù)培養(yǎng)；2 h后加入ALP底物，用分光光度計分別測量各孔450 nm波長處的光密度值（OD450）。

1．3．8 RT－PCR檢測各成骨、成脂相關(guān)基因的表達

分別收集生長狀態(tài)穩(wěn)定良好并經(jīng)礦化誘導(dǎo)或成脂誘導(dǎo)的iDPSCs和DPSCs，并用RNA提取試劑盒提取RNA。所提取的RNA經(jīng)核酸蛋白測量儀及瓊脂糖電泳檢測確定其濃度及純度后，利用Primescript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；然后以cDNA為模板，β－actin為內(nèi)參照，用熒光實時定量PCR檢測兩種干細胞中成牙相關(guān)基因DSPP、成骨相關(guān)基因RUNX2、OCN和成脂相關(guān)基因PPARγ，并根據(jù)所測得的Ct值，以2－ΔΔCt方法計算各待測基因的相對表達量。PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)條件均嚴格按試劑盒說明；所用引物由上海生工合成，各引物序列見表1。

表1 RT－PCR引物序列

1．4 統(tǒng)計學(xué)分析

使用R軟件（version 3．0．3）進行統(tǒng)計學(xué)分析，兩組獨立樣本均數(shù)（±s）比較用t檢驗，檢驗水準α＝0．05。

2 結(jié)果

2．1 DPSCs原代培養(yǎng)

炎癥組和正常組各3例牙髓組織均培養(yǎng)成功，鏡下可見組織塊貼壁后1 d即有細胞爬出；換液繼續(xù)培養(yǎng)后，炎癥組至10 d左右、正常組至8 d左右細胞匯合均達80%～90%，貼壁細胞多呈梭形或多角形的成纖維樣細胞，且胞體伸展良好、胞漿均勻、核圓、核仁清晰（圖1）。

2．2 DPSCs表面標志物的表達

流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，iDPSCs和DPSCs兩種來源的DPSCs均陽性表達CD146、CD105、CD90和CD29，而對造血系標志物CD45及內(nèi)皮系標志物CD31均不表達。兩種干細胞對各表面標志物的表達無顯著差異（P＞0．05）（圖2）。

圖1 iDPSCs和DPSCs在不同時間的形態(tài)（倒置顯微鏡×10）

圖2 iDPSCs、DPSCs流式細胞儀檢測結(jié)果

2．3 兩種干細胞的增殖能力和克隆形成能力比較

通過MTT檢測結(jié)果繪制細胞生長曲線并進行分析顯示，iDPSCs的增殖能力與DPSCs相比無顯著差異（P＞0．05）（圖3）。在單克隆形成率方面iDPSCs為0．58±0．06，DPSCs為0．56±0．04，兩種干細胞之間無顯著性差異（P＞0．05）；但iDPSCs形成的克隆略小于DPSCs（圖4）。

圖4 iDPSCs與DPSCs細胞克隆形成肉眼觀及細胞克隆數(shù)比較

2．4 兩種干細胞成骨／成牙和成脂分化潛能的比較

礦化誘導(dǎo)21d后iDPSCs和DPSCs均呈復(fù)層生長，部分細胞聚集成圓形結(jié)節(jié)狀，經(jīng)茜素紅染色后，均可見紅染的圓形礦化結(jié)節(jié)，但iDPSCs的礦化結(jié)節(jié)小于DPSCs（圖5）；ALP檢測結(jié)果顯示，兩種干細胞的ALP活性均隨著礦化誘導(dǎo)時間的延長而逐漸升高，但在各培養(yǎng)時間點兩組細胞之間的ALP活性均無顯著性差異（P＞0．05）（圖6）；RT－PCR檢測結(jié)果顯示，兩種干細胞均表達成骨相關(guān)基因RUNX2、OCN和成牙相關(guān)基因DSPP，但iDPSCs的RUNX2、OCN和DSPP表達水平均明顯低于DPSCs（P＜0．05）（圖7）。成脂誘導(dǎo)至20d后iDPSCs和DPSCs均有小泡聚集而成的脂滴形成，油紅－O染色均呈陽性反應(yīng)（圖8）；RT－PCR檢測結(jié)果顯示，兩種干細胞均表達成脂相關(guān)基因PPARγ，兩者的表達水平無顯著性差異（P＞0．05）（圖7）。

圖5 iDPSCs與DPSCs礦化誘導(dǎo)21d后茜素紅染色（10×）

圖6 iDPSCs與DPSCs礦化誘導(dǎo)后ALP活性比較

圖7 iDPSCs與DPSCs細胞分化相關(guān)基因的表達水平比較

圖8 iDPSCs與DPSCs成脂誘導(dǎo)20d后油紅O染色（10×）

3 討論

炎癥iDPSCs是從炎癥牙髓組織中提取的具有類似正常DPSCs特性的間充質(zhì)干細胞，有研究證實從恒牙炎癥牙髓中分離獲得的干細胞具有向成骨／成牙本質(zhì)分化、成脂肪、成神經(jīng)等分化的潛力［4－8］。雖然目前對iDPSCs的擴增能力和多向分化能力仍存在爭議，但不可否認的是iDPSCs在牙髓再生中具有重要的作用，使得原本因治療需要被“廢棄”的炎癥牙髓組織煥發(fā)出了新的價值，從而為牙髓再生的研究提供了新的思路。

由于臨床操作、材料來源等條件的限制，一般對于iDPSCs的提取都采用口內(nèi)直接拔髓術(shù)獲取組織樣本［4－5］。但口內(nèi)取材時樣本容易被細菌污染，故本實驗通過拔髓操作前洗必泰抗菌液漱口、PBS反復(fù)沖洗牙髓，同時配合使用可作用于G＋和G－細菌的青霉素和鏈霉素［10］，從而有效避免了細胞培養(yǎng)物的細菌污染。

國際細胞治療學(xué)會指出，間充質(zhì)干細胞的一個重要特征是陽性表達間充質(zhì)表面標志物［11］。本實驗應(yīng)用流式細胞儀對炎癥牙髓來源的干細胞表面標志物進行鑒定并與正常牙髓來源的干細胞進行了比較，結(jié)果顯示iDPSCs和DPSCs均陽性表達CD146、CD105、CD90和CD29等干細胞標志物，而對造血系標志物CD45及內(nèi)皮系標志物CD31均不表達。兩種干細胞相比，各標志物的表達強度均無顯著性差異（P＞0．05），與Perieira等［6］、Wang等［8］的研究結(jié)果相同。

原代培養(yǎng)時，細胞單克隆的形成被認為是成功分離干細胞的重要特征之一［5］。本實驗通過有限稀釋法從炎癥和正常牙髓中成功的獲得了iDPSCs和DPSCs，兩種干細胞的形態(tài)均為成纖維細胞樣的長梭形，且在細胞增殖能力和單克隆形成數(shù)／率方面二者均無顯著性差異（P＞0．05），雖然和Pereira等［6］的結(jié)果相同，但與Wang等［8］報道的炎癥牙髓細胞單克隆形成數(shù)／率顯著小于正常牙髓組的結(jié)果不同。而Huang等［4］的結(jié)果顯示炎癥牙髓細胞單克隆形成數(shù)／率與正常牙髓組無差異，但第3代到第7代iDPSCs的擴增率均要高于對應(yīng)代數(shù)的正常DPSCs組。造成以上不同結(jié)果差異的原因，我們推測可能與DPSCs供者的年齡、機體狀況、供牙牙齡的不同，以及iDPSCs和DPSCs之間生物學(xué)特性的差異有關(guān)，今后仍需進一步深入的研究。

Alongi等［5］發(fā)現(xiàn)，iDPSCs的多向分化能力弱于DPSCs；Saha［12］、Kim等［13］發(fā)現(xiàn)，iDPSCs的成骨／成牙本質(zhì)、成軟骨能力弱于正常牙髓組，成脂肪能力強于正常牙髓組。但是Wang［8］和Pereira等［6］的研究表明，iDPSCs的多向分化能力與DPSCs無明顯差異。在本實驗中，我們比較了iDPSCs與DPSCs在誘導(dǎo)分化后的成骨／成牙和成脂相關(guān)基因的表達水平，結(jié)果顯示，經(jīng)礦化誘導(dǎo)后iDPSCs成牙和成骨相關(guān)基因的表達水平均明顯低于DPSCs（P＜0．05）；經(jīng)成脂誘導(dǎo)后iDPSCs的成脂相關(guān)基因的表達水平與DPSCs相比無顯著性差異（P＞0．05），說明本實驗獲得的iDPSCs具有一定的向成骨／成牙本質(zhì)細胞、成脂細胞分化的能力，但其成骨／成牙本質(zhì)能力低于DPSCs，成脂能力無差異。

以上結(jié)果提示，iDPSCs作為一種更容易取材的ASCs具有良好的增殖能力及多向分化潛能，可在臨床上應(yīng)用于牙本質(zhì)－牙髓再生和組織工程等再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域［14－16］。但iDPSCs的成牙本質(zhì)和成骨分化潛能低于DPSCs，其具體原因和機制仍有待于進一步研究。

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Com parison of the properties of the stem cells isolated from normal and inflamed dental pulps

GUAN Li－na*，HE Ying，HAN Bing，SUN Xue－fei，YANG Fan
（*State Key Laboratory of Military Stomatology Department of Operative Dentisty＆Endodontics，School of Stomatology，The Fourth Military Medical University，Shaanxi Key Laboratory of Stomatology，Xi＇an 710032，China）

AIM：To compare the properties of stem cells isolated from normal and inflamed dental pulps．METHODS：Dental pulp stem cells from inflamed（iDPSCs）and normal pulps（DPSCs）were cultured，purified and expanded．Cell proliferation，colony formation rate，cell surface specific markers and cell differentiation－related genes were then determined after expansion．RESULTS：CD146，CD105，CD90 and CD29 were positively expressed，but CD45 and CD31 were notexpressed in both stem cells．Therewere no significant differences in cell surface specificmarker expression，cell growth and colony formation rate between the two groups（P＞0．05）．RT－PCR analysis showed that the expression of RUNX2，OCN and DSPP of iDPSCs were weaker than that of DPSCs（P＜0．05），but no significant difference was displayed in the expression of PPARγ（P＞0．05）．CONCLUSION：Themorphology，proliferation rate and differentiation potential of iDPSCs are similar to those of DPSCs．

inflammation；dental pulp stem cells；cell proliferation；cell differentiation

R780．2

A

1005－2593（2015）05－0288－07

10．15956／j．cnki．chin．j．conserv．dent．2015．05．006

2014－10－28；

：2015－03－01

國家自然科學(xué)基金資助項目（81070803，81170930）

陜西省國際合作課題（2011KW－40）

關(guān)麗娜（1974－），女，錫伯族，新疆烏魯木齊人。碩士生（導(dǎo)師：楊帆）

楊 帆，E－mail：yangfan＠fmmu．edu．cn