王培娜，王海婧，蔣文凱，賈 謙，倪龍興

（軍事口腔醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院牙體牙髓病科，陜西西安710032）

·基礎(chǔ)研究·

NLRP3炎癥體在小鼠實(shí)驗(yàn)性急性牙髓炎中的表達(dá)

王培娜，王海婧，蔣文凱，賈 謙，倪龍興

（軍事口腔醫(yī)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西省口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院牙體牙髓病科，陜西西安710032）

目的：了解NLRP3炎癥體在小鼠牙髓組織中的表達(dá)情況。方法：將40只C57BL／6J小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組及開髓6、12、24 h組（n＝10），開髓組（牙髓炎模型組）采用單純髓腔開放法建立小鼠急性牙髓炎模型，并在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死小鼠后取材，常規(guī)組織學(xué)處理后，HE染色觀察牙髓炎癥狀況，免疫組化染色檢測(cè)NLRP3在小鼠正常和炎性牙髓組織中的表達(dá)及定位。結(jié)果：HE染色觀察見牙髓炎模型組小鼠牙髓呈現(xiàn)急性炎性反應(yīng)。免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，小鼠正常牙髓組織NLRP3僅表達(dá)在成牙本質(zhì)細(xì)胞；而在炎性牙髓組織NLRP3在成牙本質(zhì)細(xì)胞和牙髓成纖維細(xì)胞均呈陽(yáng)性表達(dá)。結(jié)論：NLRP3在小鼠牙髓組織中表達(dá)并可能在急性牙髓炎的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。

NLRP3；牙髓炎；小鼠；免疫組化

［Chinese Journal of Conservative Dentistry，2015，25（5）：259］

機(jī)體的自我防御系統(tǒng)包括固有免疫（inherent immunity）和獲得性免疫（acquired immunity）兩種機(jī)制，當(dāng)細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物等病原微生物侵入機(jī)體組織時(shí)，其固有免疫系統(tǒng)作為防御侵害的第一道屏障發(fā)揮著至關(guān)重要的作用?！把装Y體（Inflammasome）”是固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，能夠快速識(shí)別各種病原微生物，從而發(fā)揮免疫防御作用。NLRP3炎癥體是NLRs（nucleotide－binding oligomerization domain－like receptors，NLRs）家族中研究比較深入的一種炎癥因子，它是Caspase活化時(shí)的反應(yīng)平臺(tái)，而活化的Caspase－1通過調(diào)控下游分子IL－1β和IL－18的成熟和分泌［1］，進(jìn)而參與機(jī)體的炎癥反應(yīng)。牙髓組織作為機(jī)體的一部分，是否遵循機(jī)體的固有免疫機(jī)制，通過NLRP3炎癥體來(lái)感知微生物并對(duì)其產(chǎn)生防御反應(yīng)，是我們亟需研究的一個(gè)課題。本實(shí)驗(yàn)通過建立小鼠實(shí)驗(yàn)性急性牙髓炎模型，觀察NLRP3在小鼠牙髓組織中的表達(dá)及定位，了解NLRP3在牙髓炎發(fā)生發(fā)展過程中的作用，以期為牙髓炎的治療提供新的理論依據(jù)和思路。

1 材料和方法

1．1 主要試劑和儀器

40 g／L水合氯醛（分析純AR，上海山浦化工有限公司）；40 g／L多聚甲醛（AR－0211，北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司）；兔抗小鼠NLRP3抗體（sc－66846，Abcam公司，美國(guó)）；免疫組化試劑盒（SV0002，武漢博士德）；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物稱量用電子秤（DST671，蘇州市蘇杭科技器材有限公司）；牙科高速渦輪機(jī)（TC－169，上海市通用齒材設(shè)備電子有限公司）；牙科手機(jī)（PANA－AIR－S－M4，NSK，日本）；體視顯微鏡（SXP－1C，上海醫(yī)光儀器有限公司）；組織脫水機(jī)（TS－12U）、組織包埋機(jī)（BM－IX）、溫控?fù)破瑱C(jī)（CS－VI）（孝感宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司）；石蠟切片機(jī)（RM2235，Leica，德國(guó)）；正置顯微鏡成像系統(tǒng)（BX－43，Olympus，日本）。

1．2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

選取6周齡C57BL／6小鼠（體質(zhì)量20～25 g，雌雄各半，共40只（購(gòu)于第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。隨機(jī)選取30只為炎癥模型組，另外10只為正常對(duì)照組。炎癥模型組按髓腔開放時(shí)間分為6、12、24 h組（n＝10）；正常對(duì)照不作開髓處理。

1．3 小鼠牙髓炎模型的建立和取材

炎癥模型組30只小鼠以40 g／L水合氯醛按0．01mL／g腹腔注射麻醉后，仰位固定于小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)臺(tái)，用眼科鑷撐開小鼠口腔，暴露上頜磨牙，以750mL／L乙醇消毒上頜磨牙。體視顯微鏡下用裝有1／4圓鉆的高速渦輪機(jī)在小鼠右側(cè)上頜第一、二磨牙牙合面不噴水鉆磨，待有透紅點(diǎn)時(shí)停止磨切，用金屬探針在透紅點(diǎn)加壓，形成穿髓孔后開放髓腔不作其他處理。實(shí)驗(yàn)組小鼠分別在建模后6、12、24 h脫頸處死，然后將上頜第一、二、三磨牙連同部分上頜骨一并取材。正常組在建模前處死取材。

1．4 牙髓組織切片的制作和染色觀察

將標(biāo)本置于40 g／L多聚甲醛中固定24 h，經(jīng)170 g／L EDTA脫鈣20 d后流水沖洗1 h；然后將其置于脫水機(jī)中逐漸脫去組織中的水分，再將組織塊置于二甲苯中透明；經(jīng)透明處理后的組織塊置于融化的石蠟中，待石蠟完全浸入組織塊后進(jìn)行包埋。制作5μm厚的石蠟切片，行蘇木精－伊紅（HE）染色，光鏡觀察。

1．5 免疫組化染色

制作3μm厚石蠟切片，常規(guī)脫蠟，梯度乙醇脫水，PBS沖洗3 min×3次；3 mL／L甲醇－H2O2室溫孵育15 min以封閉內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗3min×3次；1 g／L胰蛋白酶37℃孵箱消化30min以暴露細(xì)胞內(nèi)抗原，PBS沖洗3min×3次；100 mL／L胎牛血清封閉30 min后滴加NLRP3（1∶100）一抗，37℃濕盒中2 h，4℃過夜，PBS沖洗3min×5次；滴加山羊抗兔二抗（1∶200），37℃避光孵育30 min，PBS沖洗3 min×5次；DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察NLRP3陽(yáng)性細(xì)胞。陰性對(duì)照組用PBS緩沖液代替一抗，其他同前所述，觀察正常和炎癥牙髓組織中NLRP3的表達(dá)。

2 結(jié)果

2．1 組織學(xué)觀察

小鼠右側(cè)上頜第一、二磨牙牙髓組織的HE切片顯示，正常對(duì)照組：牙髓腔內(nèi)牙本質(zhì)細(xì)胞層細(xì)胞排列正常，胞質(zhì)均勻淡染，炎癥細(xì)胞極少；炎癥模型組：穿髓點(diǎn)下方可見中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，隨著開髓時(shí)間的延長(zhǎng)，牙髓組織炎癥逐漸加重，牙本質(zhì)細(xì)胞層細(xì)胞排列紊亂，牙髓血管擴(kuò)張充血，血管周圍紅細(xì)胞外滲，冠髓可見少許壞死組織（圖1）。

2．2 免疫組化觀察

根據(jù)HE染色結(jié)果選擇牙髓炎特征比較明顯的12 h為代表進(jìn)行免疫組化染色，結(jié)果顯示，正常小鼠牙髓組織：NLRP3蛋白在成牙本質(zhì)細(xì)胞中呈陽(yáng)性表達(dá)，而在牙髓成纖維細(xì)胞中表達(dá)極少，陰性對(duì)照組各類細(xì)胞中均無(wú)NLRP3表達(dá)；炎性牙髓組織：排列紊亂的成牙本質(zhì)細(xì)胞及多種炎癥細(xì)胞中NLRP3均呈陽(yáng)性表達(dá)，炎性病灶周邊的牙髓成纖維細(xì)胞中亦表達(dá)NLRP3，而陰性對(duì)照組各類細(xì)胞均無(wú)NLRP3表達(dá)（圖2）。

圖1 對(duì)照組及炎癥模型組小鼠牙髓組織病理學(xué)觀察（HE，×200）

圖2 小鼠牙髓組織中NLRP3的表達(dá)

3 討論

牙髓炎是由于牙髓組織受到細(xì)菌感染或物理、化學(xué)因素的刺激而發(fā)生的一種炎癥性病變［2］。作為口腔常見病和多發(fā)病，到目前為止其發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸過程中仍有很多問題尚不清楚，建立一種有效的動(dòng)物模型是牙髓炎研究的重要基礎(chǔ)。以往的牙髓炎模型多選用在生物進(jìn)化、組織結(jié)構(gòu)及器官形態(tài)功能與人類較為接近的猴、狗、小型豬等動(dòng)物，也有選擇兔、貓、大鼠等小型動(dòng)物作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，均取得了成功。而小鼠因其體積小、口內(nèi)空間狹窄、操作困難等缺點(diǎn)，很少用于牙髓炎動(dòng)物模型的構(gòu)建。然而作為基因敲除技術(shù)的重要載體，小鼠在牙髓炎的研究中有其他動(dòng)物無(wú)法替代的作用，因此建立小鼠實(shí)驗(yàn)性牙髓炎模型有著積極的意義。

根據(jù)小鼠磨牙小的特點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)利用體視顯微鏡進(jìn)行單純髓腔開放法構(gòu)建小鼠實(shí)驗(yàn)性牙髓炎模型。HE切片結(jié)果顯示：正常組牙髓組織中鮮有炎癥細(xì)胞，而開髓后6 h組在開髓口附近可見炎癥細(xì)胞增多；隨著時(shí)間的推移，12、24 h組炎癥反應(yīng)明顯加重，牙髓血管充血擴(kuò)張，牙本質(zhì)細(xì)胞排列紊亂?；谏鲜霾±碜兓?，我們認(rèn)為構(gòu)建小鼠實(shí)驗(yàn)性牙髓炎模型是一種可行的方法，為后續(xù)研究提供了可靠的動(dòng)物模型。

真核生物具有復(fù)雜的免疫識(shí)別系統(tǒng)，其對(duì)病原體的識(shí)別主要依賴于病原相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs）的受體介導(dǎo)，這些受體稱為模式識(shí)別受體（pattern recognion receptor，PRR）［3］。在固有免疫反應(yīng)中，正是通過PRR對(duì)PAMPs的識(shí)別來(lái)抵抗病原微生物的入侵，為機(jī)體的防御筑起了第一道防線［4－5］。研究發(fā)現(xiàn)，NLRs由N端的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（CARD、PYD和BIR）、C端的亮氨酸重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域（LRR）和中間部分的核苷酸寡聚化結(jié)構(gòu)域（NACHT）構(gòu)成，是細(xì)胞內(nèi)PRR中一個(gè)很大的蛋白家族［6］。能夠識(shí)別胞內(nèi)菌等細(xì)胞內(nèi)危險(xiǎn)信號(hào)分子［7－8］，并參與不同信號(hào)通路的激活［9－10］，從而促進(jìn)炎癥因子的產(chǎn)生，啟動(dòng)機(jī)體固有免疫應(yīng)答。Martinon等［11］研究發(fā)現(xiàn)具有NACHT、LRR、PYD結(jié)構(gòu)域的蛋白與凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（ASC）能夠形成一個(gè)多蛋白復(fù)合體，稱為“炎癥體”，而通過形成炎癥體發(fā)揮作用的分子主要有4個(gè)（NLRP1、NLRP3、IPAF和AIM－2），其中NLRP3炎癥體是目前研究最多也最為明確的一個(gè)炎癥體。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常小鼠牙髓組織中，成牙本質(zhì)細(xì)胞中NLRP3呈陽(yáng)性表達(dá)，牙髓成纖維細(xì)胞中NLRP3幾乎不表達(dá)；而在炎性牙髓組織中，排列紊亂的成牙本質(zhì)細(xì)胞及多種炎癥細(xì)胞均有NLRP3表達(dá)，炎性病灶周邊的牙髓成纖維細(xì)胞亦表達(dá)NLRP3。該結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)當(dāng)病原微生物侵入牙髓組織時(shí)，非免疫的牙髓成纖維細(xì)胞活化，分泌炎性細(xì)胞因子，參與免疫應(yīng)答反應(yīng)［12］。而病原微生物及其產(chǎn)物是否通過NLRP3影響成牙本質(zhì)細(xì)胞，并進(jìn)一步參與反應(yīng)性牙本質(zhì)的形成，以及成纖維細(xì)胞如何被活化尚需深入研究。

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Expression of NLRP3 inflammasome in experimental acute pulpitis in m ice

WANG Pei－na，WANG Hai－jing，JIANGWen－kai，JIA Qian，NILong－xing
（State Key Laboratory of Military Stomatology，Department of Operative Dentistry and Endodotics，School of Stomatology，The Fourth Military Medical University，Shaanxi Key Laboratory of Stomatology，Xi′an 710032，China）

AIM：To investigate the expression of NLRP3 inflammasome in dental pulp tissues of experimental acute pulpitis inmice．METHODS：40C57BL／6Jmice were randomly divided into 4groups（n＝10）．Themice in control group received no treatment．The dental pulps of themice in other 3 groupswere exposed for 6，12 and 24 h，respectively．At different time points，the animalswere sacrificed and pulp tissueswere examined by HE staining．NLRP3 expression was observed by immunohistochemical staining．RESULTS：HE staining revealed acute inflammation in the pulp of experimentalmice．NLRP3 was detected in the cytoplasm of odontoblasts in normal dental pulps．In the inflammatory pulp tissues，both odontoblasts and fibroblasts expressed NLRP3．CONCLUSION：NLRP3 is expressed in the normal and inflammatory pulp tissues，and possibly plays an important role in the development of pulpitis．

NLRP3；pulpitis；mice；immunohistochemistry

R780．2

A

1005－2593（2015）05－0259－04

10．15956／j．cnki．chin．j．conserv．dent．2015．05．001

2014－12－26；

：2015－02－28

國(guó)家自然科學(xué)基金資助（81170946，81371139）

王培娜（1988－），女，漢族，河北邯鄲人。碩士生（導(dǎo)師：倪龍興）

倪龍興，E－mail：nilongx＠fmmu．edu．cn