連帥，王瑞云，2，*，馬躍敏，劉笑瑜，季煦

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030031)

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不同生態(tài)區(qū)糜子種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析

連帥1，王瑞云1，2，*，馬躍敏1，劉笑瑜1，季煦1

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.農(nóng)業(yè)部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030031)

以5個(gè)糜子栽培生態(tài)區(qū)的40份糜子種質(zhì)資源為試材，利用5個(gè)糜子特異性SSR標(biāo)記對試材進(jìn)行遺傳多樣性分析，旨在為糜子核心種質(zhì)的構(gòu)建和篩選提供一定的理論基礎(chǔ)。結(jié)果表明：40份材料中共檢測出15個(gè)等位基因變異，平均每個(gè)位點(diǎn)3個(gè); 40份材料間的遺傳相似系數(shù)為0.692～0.726; 聚類分析將試材分為5類，分別位于東北春糜子區(qū)、華北夏糜子區(qū)、北方春糜子區(qū)、黃土高原春夏糜子區(qū)和南方秋冬糜子區(qū)。同時(shí)，測定了以上試材的形態(tài)和生理指標(biāo)(株高、主穗長和葉綠素含量)，發(fā)現(xiàn)試材間存在多樣性：(1)40個(gè)糜子材料的旗葉葉綠素含量介于27.23～43.10 g·L-1之間，倒二葉葉綠素含量介于17.00～41.17 g·L-1之間，其中185號(hào)材料(紅糜子)葉綠素含量均最大。(2)40份材料的株高介于119.73～273.97 cm之間；其中，60號(hào)材料(鎮(zhèn)原大糜子)最高，為273.97 cm，247號(hào)材料(黑糜子)最低，為119.73 cm；(3)主穗長介于17.00～66.07 cm；其中257號(hào)材料(黑糜子)最長，為66.07 cm，265號(hào)材料(鵝頭)最短，為17.00 cm。通過對糜子材料部分形態(tài)、生理指標(biāo)及5對糜子特異性SSR標(biāo)記分析了遺傳多樣性，從聚類結(jié)果得出，SSR標(biāo)記出的糜子多態(tài)性表現(xiàn)出了一定的地域性。

糜子；親緣關(guān)系；SSR標(biāo)記；聚類分析；多樣性分析

糜子(PanicummiliaceumL.)是禾本科黍?qū)僖荒晟荼局参?，耐溫喜光，為短日照C4植物，生育期短，適合在各種土壤上生長，尤其是在貧瘠的沙壤土上，自然災(zāi)害發(fā)生的年份還可以作為救災(zāi)作物[1]。作為一種古老的農(nóng)作物，糜子種植已有10 000多年的歷史[2]，起源于中國，是干旱和半干旱地區(qū)的主要糧食作物[3]。全世界糜子栽培面積約550～600萬hm2，俄羅斯、烏克蘭和中國栽培面積最大[1]。我國共收集到糜子種質(zhì)資源10 200份，國家儲(chǔ)備8 849份[4]。我國糜子資源廣布于全國各省，分別屬于7個(gè)糜子栽培區(qū)(東北春糜子區(qū)、華北夏糜子區(qū)、北方春糜子區(qū)、黃土高原春夏糜子區(qū)、西北春夏糜子區(qū)、青藏高原春糜子區(qū)和南方秋冬糜子區(qū))[5]。糜子種質(zhì)資源的多樣性為生產(chǎn)和育種提供了更大空間。

有關(guān)糜子的多樣性研究(形態(tài)、解剖、生理生化及分子遺傳等方面)已經(jīng)取得長足進(jìn)展。胡興雨等[6]對國家種質(zhì)資源庫中收集保存的8 016份黍稷種質(zhì)資源的株高、千粒重、生育期等11個(gè)農(nóng)藝性狀進(jìn)行主成分分析和聚類分析，將其分成5大組群，各個(gè)組群都有一定的形態(tài)學(xué)特征，為有效利用這些資源提供了理論依據(jù)。王綸等[7]采用反復(fù)干旱法，對山西省有代表性的500份黍稷種質(zhì)資源進(jìn)行了抗旱性鑒定評價(jià)，篩選出9份一級(jí)高度抗旱的種質(zhì)。對一級(jí)高度抗旱的種質(zhì)又進(jìn)行了田間抗旱生理指標(biāo)氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率、光合速率的測定和實(shí)驗(yàn)室離體葉片含水量的測定，進(jìn)一步驗(yàn)證了反復(fù)干旱法對大批量黍稷種質(zhì)資源抗旱性鑒定。王瑞云等[8]以6個(gè)糜子栽培生態(tài)區(qū)的18個(gè)糜子種質(zhì)為材料，調(diào)查了糜子6個(gè)生育時(shí)期的8項(xiàng)形態(tài)、解剖及生理指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)糜子耐旱性因生態(tài)區(qū)的不同而不同，寧夏的“八升半”為較耐旱種質(zhì)，山西的黃糧黍較不耐旱。慕芳等[9]通過對糜子葉表面結(jié)構(gòu)的掃描電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)其葉上下表面均有較厚的角質(zhì)膜和蠟質(zhì)，葉表面分布有3種類型的表皮毛。上述葉的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)反映出糜子抗旱性的特征。近年來，隨著分子遺傳學(xué)和基因工程的迅速發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛用于作物品種鑒定、純度鑒定、親緣關(guān)系鑒定、雜種優(yōu)勢和遺傳多樣性分析等研究領(lǐng)域。糜子中已有AFLP[10,11]、RAPD[12]和ISSR[13]標(biāo)記構(gòu)建及運(yùn)用的研究。Karam等[10,11]分別用AFLP及銀染AFLP標(biāo)記檢測糜子遺傳多樣性，但12份材料均來源于美國和加拿大，沒有中國的。Lagler等[13]采用9個(gè)草莓屬植物的ISSR標(biāo)記檢測了21份匈牙利糜子，發(fā)現(xiàn)只有7個(gè)引物可擴(kuò)增出DNA片段，共檢測到15個(gè)ISSR等位基因。但是關(guān)于從糜子基因組中分離微衛(wèi)星序列或基于微衛(wèi)星標(biāo)記體系的構(gòu)建方面的相關(guān)信息仍很缺乏[14]。2008年，Hu等[15]選取了水稻、小麥、大麥和燕麥的46個(gè)SSR標(biāo)記分析了來源于中國不同生態(tài)區(qū)的118份糜子材料的遺傳變異。2010年，Cho等[13]通過構(gòu)建糜子基因組DNA的富SSR文庫，發(fā)展了25個(gè)多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記，并對其穩(wěn)定性進(jìn)行了鑒定。Hunt等通過驗(yàn)證Cho等為糜子開發(fā)的25個(gè)SSR標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)其中只有16個(gè)標(biāo)記穩(wěn)定性較好，并且已利用這些標(biāo)記分析了包括33份中國材料在內(nèi)的來源于歐亞大陸的98份糜子的遺傳多樣性[16]。本研究利用5對糜子特異性引物分析來源于中國的40份糜子資源的遺傳多樣性，旨在為糜子核心種質(zhì)的構(gòu)建和篩選提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供的40個(gè)糜子種質(zhì)資源(表1、圖1)為試材。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 株高和主穗長的測定

用游標(biāo)卡尺分別測量不同糜子材料的株高和主穗長度。

1.2.2 葉綠素含量的測定

用SPAD-502葉綠素測定儀測旗葉和倒二葉的葉綠素含量。

1.2.3 PCR擴(kuò)增及等位基因檢測

選取5對糜子特異性SSR引物[3](表2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。CTAB法提取糜子葉片DNA。PCR體系(20.2 μL)包括ddH2O 13.6 μL ，10×Taq Buffer 2 μL，dNTP 1 μL，上下游引物各0.4 μL，Taq DNA 聚合酶0.2 μL和模板DNA 3 μL。PCR 程序?yàn)? 94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃退火 45 s，72 ℃延伸30 s，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物采用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel、SAS統(tǒng)計(jì)軟件，運(yùn)用方差分析處理數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析(One-way ANOVA)比較不同生態(tài)區(qū)種質(zhì)間的差異性，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

表1 供試糜子種質(zhì)及其來源Table 1 The accessions and origin of broomcorn millet

圖1 40個(gè)糜子材料地理分布圖Fig.1 The geographical distribution of broomcorn millet germplasm

表2 SSR引物詳情Table 2 SSR primers for details

在電泳膠板上，相同位置出現(xiàn)帶的記為‘1’，無帶則記為 ‘0’，將所有SSR引物所擴(kuò)增帶的結(jié)果輸入數(shù)據(jù)表，利用NTSYS-pc軟件統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)算遺傳距離(GD)，采用非加權(quán)平均法(UPGMA)構(gòu)建樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同糜子種質(zhì)形態(tài)、生理指標(biāo)的多樣性分析

測定了40份糜子材料的4項(xiàng)形態(tài)和生理指標(biāo)(表3)。由表3可以看出，不同糜子材料的株高、主穗長、旗葉葉綠素含量和倒二葉葉綠素含量都有顯著差異(P<0.05)。40份材料的株高介于119.73～273.97 cm之間；其中，60號(hào)材料最高，為273.97 cm，247號(hào)材料最低，為119.73 cm；40份材料的主穗長介于17.00～66.07 cm之間；其中，257號(hào)材料最長，為66.07 cm，265號(hào)材料最短，為17.00 cm。就旗葉葉綠素含量而言，40個(gè)糜子材料的葉綠素含量介于27.23～43.10 g·L-1之間，其中185號(hào)最大，62號(hào)最小。就倒二葉葉綠素含量而言，40個(gè)糜子材料的葉綠素含量介于27.93～41.17 g·L-1，其中185號(hào)最大，62號(hào)最小。

表3 不同糜子種質(zhì)形態(tài)和生理指標(biāo)比較Table 3 The comparision of morphological and index plysiological of broomcorn millets

續(xù)表3

種質(zhì)編號(hào)Code株高/cmHeight/cm主穗長/cmLengthofmainspike/cm旗葉葉綠素含量/g·L-1CF/g·L-1倒二葉葉綠素含量/g·L-1CS/g·L-179183.40±1.08op37.47±0.66mn33.13±1.20efghijklm33.33±0.80defghijk136174.53±0.78rs39.57±0.79lm28.80±1.08klm32.37±0.84fghijk143216.47±0.71hi53.03±0.41cd30.63±0.80ijklm32.33±0.33fghijk163230.67±1.18e48.60±0.40fgh31.67±1.24hijklm32.97±1.62fghijk178165.47±1.78t27.37±1.43q39.10±3.56abcd37.33±3.12abcdefg185138.67±1.47t42.60±0.74jkl43.10±1.62a41.17±1.58a189147.00±0.87s47.63±0.43ghi39.60±1.50abc40.77±1.82ab191216.50±1.27hi42.50±1.10jkl33.17±2.23defghijklm34.10±0.89cdefghij192150.30±1.46s42.40±1.08jkl37.73±0.86abcdefg37.93±0.78abcdef193199.07±0.82m49.23±0.92efgh33.40±1.06defghijkl34.27±0.57cdefghij199177.37±1.50rq48.93±1.11efgh38.87±1.68abcde38.67±1.62abcde202225.77±2.54f34.47±2.68n33.43±1.28defghijkl35.37±0.84bcdefghi207219.50±2.31gh50.93±1.45cdefg31.50±3.93hijklm35.27±3.16bcdefghi208214.77±2.15ji47.87±2.46ghi38.63±1.41abcdef38.80±1.06abcd210180.27±1.79pq34.33±1.59po34.40±1.22cdefghijk36.07±1.16abcdefgh214180.10±1.30pq54.50±0.99c38.10±2.37abcdef35.83±1.19abcdefgh228175.03±1.88rs41.00±1.32l38.23±1.07abcdef38.70±1.37abcde233166.87±1.68t44.57±1.68ijk38.87±1.85abcde36.73±1.16abcdefg236197.47±1.88m49.77±1.41defg35.57±1.75bcdefghij37.13±1.32abcdefg241203.40±1.91l45.87±1.16hij31.50±0.26hijklm33.73±0.33defghij242215.27±1.60hi44.73±1.47ijk28.83±0.62klm30.10±0.99ijk244156.57±1.39u47.27±0.81ghi34.13±0.41cdefghijk32.17±0.48ghijk246219.17±0.65gh47.73±0.74ghi31.43v1.83hijklm31.93±0.58ghijk247119.73±1.63u41.90±1.06kl27.63±0.94lm29.13±1.01jk257269.53±1.35b66.07±0.89a33.47±0.67defghijkl32.37±3.30fghijk258210.97±1.18jk50.93±0.69cdefg31.23±0.32ijklm33.37±0.43defghijk265174.13±1.92rs17.00±0.56r32.83±1.13fghijklm34.80±0.71cdefghi266250.33±1.52c54.07±0.95c35.33±0.23bcdefghij36.87±0.75abcdefg

注：表內(nèi)數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；每列數(shù)據(jù)右側(cè)字母不同者表示差異顯著(P<0.05)。

Note：Values are mean ± SD.Values within a column followed by a different letter are significantly different atP<0.05.

2.2 不同糜子種質(zhì)遺傳多樣性分析

利用5對SSR引物分析了40份糜子材料的遺傳多樣性，結(jié)果見表4。由表4可以看出，PIC值介于0.30～0.61之間，引物GB-PaM-115(圖2)和GB-PaM-134的PIC>0.5時(shí)，該引物為高度多態(tài)性信息引物；引物GB-PaM-121(圖3)、GB-PaM-126和GB-PaM-145(0.25

表4 SSR引物多態(tài)性分析Table 4 Diversity assessment based on SSR primers

圖2 引物GB-PaM-115擴(kuò)增后的條帶Fig.2 Polymorphism amplified by primer GB-PaM-115

圖3 引物GB-PaM-121擴(kuò)增后的條帶Fig.3 Polymorphism amplified by primer GB-PaM-121

由圖4可以看出，40個(gè)糜子種質(zhì)分布于5大生態(tài)區(qū)，基本符合糜子栽培生態(tài)區(qū)，但也有例外。例如材料185號(hào)(紅糜子)和191號(hào)(白糜子)栽培于東北春糜子區(qū)，但是聚類結(jié)果將其分在了黃土高原春夏糜子區(qū)，具體原因有待深入研究。由圖4可以看出，在遺傳相似系數(shù)為0.62處，將糜子種質(zhì)分為兩類：金守黍和貍黍子分布于南方秋冬糜子區(qū)；其它的糜子常種植于北方。在遺傳相似系數(shù)為0.656處，將糜子種質(zhì)分為三類：第一類種植于北方春糜子區(qū)、黃土高原春夏糜子區(qū)；第二類種植于東北春糜子區(qū)、華北夏糜子區(qū)；第三類種植于南方秋冬糜子區(qū)。在遺傳相似系數(shù)為0.71處，將糜子種質(zhì)分為五類：第一類的9個(gè)材料來源于內(nèi)蒙、甘肅地區(qū)，屬于北方春糜子區(qū)；第二類的11個(gè)材料來源于山西、陜西、寧夏和甘肅等地區(qū)，屬于黃土高原春夏糜子區(qū)；第三類的13個(gè)材料來源于黑龍江、吉林和遼寧等地區(qū)，屬于東北春糜子區(qū)；第四類的5個(gè)材料來源于河北，屬于華北夏糜子區(qū)；第五類的2個(gè)材料分別來源于廣東和安徽，屬于南方秋冬糜子區(qū)。從聚類結(jié)果看，SSR標(biāo)記出的糜子多態(tài)性表現(xiàn)出了一定的地域性。

3 討論與結(jié)論

我國黍稷種質(zhì)資源的研究從農(nóng)藝性狀的分析評價(jià)、品質(zhì)分析、抗逆性分析到細(xì)胞學(xué)鑒定，取得了很大成果。2008年，胡興雨等[6]對8 016份黍稷種質(zhì)資源進(jìn)行了農(nóng)藝性狀主成分分析和聚類分析。分成5大組群，各個(gè)組群都有一定的形態(tài)學(xué)特征，為有效利用這些資源提供理論依據(jù)。2011年，Hunt[16]等利用16個(gè)糜子特異性標(biāo)記分析了98份糜子的遺傳多樣性，但是其中僅包括33份中國材料。在品種鑒定及遺傳多樣性研究方面，SSR是一種很常用且普遍有效的分子標(biāo)記，在實(shí)踐研究中已成為一種重要手段。本試驗(yàn)利用Hunt等[16]驗(yàn)證過的5對糜子特異性SSR標(biāo)記分析了40個(gè)中國糜子材料的遺傳多樣性，同時(shí)調(diào)查部分形態(tài)和生理指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)相似系數(shù)為0.71處可將40個(gè)材料分為五大類，糜子的多態(tài)性表現(xiàn)出了一定的地域性。

圖4 40個(gè)糜子品種聚類圖Fig.4 Dendrogram of broomcorn millet germplasm

目前，我們課題組已經(jīng)收集到400份來源于中國不同生態(tài)區(qū)的糜子資源，正在設(shè)計(jì)和篩選更多的引物，從多層次、多角度分析中國糜子種質(zhì)資源的多樣性，期望對糜子核心種質(zhì)的篩選和構(gòu)建提供一定的理論基礎(chǔ)。

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(編輯：武英耀)

Genetic Diversity of Broomcorn Millet (PanicummiliaceumL.) Germplasms of Different Ecotype Zone of China

Lian Shuai1,Wang Ruiyun1，2，*,Ma Yuemin1,Liu Xiaoyu1,Ji Xu1

(1.CollegeofAgriculture,ShanxiAgriculturalUniversity,TaiguShanxi030801,China；2.KeyLaboratoryofCropGeneResourcesandGermplasmEnhancementonLoessPlateau，MinistryofAgriculture，TaiyuanShanxi030031，China)

Using 40 broomcorn millet germplasm resources as material,the genetic diversity was analyzed based on 5 simple sequence repeat (SSR) markers,to provide certain theoretical basis for the construction of core germplasm corn millet and filtering.The results showed: 15 alleles were detected among the materials,3 alleles were the average per locus.Genetic similarity coefficient among 40 accessions ranged from 0.692～0.726,which were classified into five categories including North China Spring Millet area,Summer millet area,Northern spring millet area in the Loess Plateau,the Spring and Summer millet zone and the South autumn and winter millet area,respectively.Meanwhile,the morphology and physiological indexes (plant height,ear length and the chlorophyll content)of the material were assayed.The results showed : (1) The chlorophyll content of flag leaf of the 40 accessions ranged from 27.23 g·L-1to 43.10 g·L-1,the chlorophyll content of blade in the second leaf from top ranged from 27.93 g·L-1to 41.17 g·L-1; among them the accession of No.185 (Hong mizi) was the biggest.(2) The plant height of the 40 accessions were ranged from 119.73 cm to 273.97 cm,among them,Accession 60 and 247 were the highest and the lowest,respectively; (3) The panicle length of main spike among all the accessions were ranged from 17.00 cm to 66.07 cm,257 and 265 were the longest and the shortest,respectively.Analyzed the genetic diversity through some of the physiological indicators and five pairs of millet specific SSR markers of millet material.Derived from the clustering results,SSR markers out of millet polymorphism showed some regional.

PanicummiliaceumL; Genetic relationship; SSR marker; Cluster analysis; Diversity analysis

2014-11-04

2014-12-16

連帥(1991-)，男(漢)，山西臨汾人，碩士研究生，研究方向：植物分子育種

*通訊作者：王瑞云，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師。Tel: 15234420135；E-mail: wry925@126 com

國家自然科學(xué)基金(31271791)

S516

A

1671-8151(2015)03-0225-07