賈文斌 孫欣 杜志杰 郭建昇

結(jié)腸癌是西歐、北美等發(fā)達(dá)國家最常見的惡性腫瘤，也是我國九大常見惡性腫瘤之一。在過去30多年的時間里，包括我國在內(nèi)的多數(shù)國家或地區(qū)結(jié)腸癌發(fā)病率呈上升趨勢。在我國因結(jié)腸癌死亡者，男性居惡性腫瘤死亡的第5位，女性居第6位。從流行病學(xué)的觀點看，結(jié)腸癌的發(fā)病與社會環(huán)境、生活方式（尤其是飲食習(xí)慣、缺乏體力活動）、遺傳因素有關(guān)。年齡、結(jié)直腸息肉史、潰瘍性結(jié)腸炎及膽囊切除史也是結(jié)腸癌的高危因素[1-2]。但總體而言，結(jié)腸癌的病因似不十分清楚。60%以上結(jié)腸癌患者被確診時已經(jīng)失去根治手術(shù)機(jī)會，因此術(shù)后化療成為主要治療辦法，但化療藥物的毒副作用及患者自身的耐藥性是目前影響患者預(yù)后的相關(guān)因素。

青蒿素（artemisine）是從中藥黃花蒿中提取的有過氧基團(tuán)的倍半萜內(nèi)酯抗瘧新藥。青蒿素是中國發(fā)現(xiàn)的第一個被國際公認(rèn)的天然藥物，在其基礎(chǔ)上合成了多種衍生物，如雙氫青蒿素、蒿甲醚、青蒿琥酯等。青蒿素類藥物毒性低、抗虐性強(qiáng)，被WTO批準(zhǔn)為世界范圍內(nèi)治療腦型瘧疾和惡性瘧疾的首選藥物[3]。除上述作用外，還發(fā)現(xiàn)青蒿素對白血病、黑色素瘤、結(jié)腸癌、前列腺癌和乳腺癌細(xì)胞株高度敏感，有效抑制癌細(xì)胞的增殖[4]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗藥物 青蒿琥酯（廣西桂林南藥股份有限公司，批號：LA120306）

1.1.2 實驗儀器 CO2培養(yǎng)箱（Heal Force，型號：HP900），酶標(biāo)儀（美國Thermo，型號：5250030），倒置顯微鏡（Olympus，型號：CKX41SF），流式細(xì)胞儀（美國B-D公司，型號：Facscalibur）。

1.1.3 實驗試劑 人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116和HT29細(xì)胞來自于山西醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生理學(xué)省部共建教育部重點實驗室，10%無支原體小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批號：121004），噻唑蘭（Biotopped，批號：410C055），二甲基亞砜 （Solarbio，批號：302A035），DMEM高糖培養(yǎng)基（Hyclone，批號：NYF0905），0.25% 胰酶（Hyclone，批號：NWM0527），凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號：130605）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人結(jié)腸癌CHT116和HT29細(xì)胞復(fù)蘇后采用RPMI 1640培養(yǎng)液、37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2~3 d換液1次，取對數(shù)期生長細(xì)胞用于檢測。每組實驗重復(fù)3次。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞抑制率 取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液密度為5×104個/mL，每孔200 μL鋪于96孔板。培養(yǎng)24 h后細(xì)胞貼壁，棄去培養(yǎng)液，加入不同濃度（7.5、15、30、60、120 μg/mL）青蒿琥酯，每種濃度設(shè)5個復(fù)孔，每孔200 μL。同時設(shè)置空白孔（只加培養(yǎng)液）、陰性對照孔（只加細(xì)胞和培養(yǎng)液）。37 ℃、5%CO2：培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)48 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入20 μL MTT溶液（MTT質(zhì)量濃度為5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150 μL，于搖床低速振蕩10 min。在酶標(biāo)儀490 nm波長處測量每孔的吸光度（A）值。整理數(shù)據(jù)后計算細(xì)胞抑制率，使用SPSS 13.0軟件計算IC50值。每組實驗重復(fù)5次。

細(xì)胞抑制率=[1-（實驗孔A值-空白孔A值）/（陰性對照孔A值-空白孔A值）]×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液密度為1×105個/mL，每孔l mL接種于6孔板，每孔各加1 mL培養(yǎng)液，吹打均勻后放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。單層細(xì)胞鋪滿板底后，加入不同濃度的青蒿琥酯培養(yǎng)液（0、60、120 μg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞到10 mL離心管。每樣本細(xì)胞數(shù)為1×106個左右。離心半徑13.5 cm，1000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液，PBS 5 mL懸浮細(xì)胞。濾網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，離心半徑13.5 cm，1000 r/min離心5 min，棄去上清液加入500 μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞；加入5 μL Annexin V—FITC混勻后，加入5 μL Propidium Iodide，混勻；室溫避光，反應(yīng)5~15 min；在1 h內(nèi)，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行觀察和檢測。每組實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 青蒿琥酯對細(xì)胞增殖的影響 人結(jié)腸癌細(xì)胞經(jīng)不同濃度青蒿琥酯處理后，細(xì)胞生長受到不同程度的抑制（表1），且抑制程度隨著藥物濃度的增加而增強(qiáng)。不同濃度青蒿琥酯處理同種細(xì)胞后，抑制率間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；相同藥物濃度下兩種細(xì)胞之間抑制率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。青蒿琥酯作用HCT119和HT29細(xì)胞48 h后的IC50值分別為57.34 μmol/L 和 26.64 μmol/L。

表1 不同濃度Art對HCT116和HT29的抑制作用比較（x-±s）%

2.2 青蒿琥酯對人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡率的影響 隨青蒿琥酯濃度升高，作用24 h后兩種人結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡率均逐漸上升，加藥組與陰性對照組凋亡率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表2、圖1~6。

3 討論

目前手術(shù)、化療、放療仍是結(jié)腸癌治療的主要方法，但中藥因其獨特的生物調(diào)節(jié)功能也日益發(fā)揮著突出的作用。青蒿琥酯作為一種中藥成分，臨床上主要用于抗瘧疾方面的治療。近年發(fā)現(xiàn)其能發(fā)揮一定的抗腫瘤作用。Therese Ericsson等[5]長期臨床觀察發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯在乳腺癌患者中治療中具有意義；Yang等[6]發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯在細(xì)胞溶酶體中積累，促進(jìn)溶酶體功能和鐵蛋白退化，然后導(dǎo)致線粒體ROS生產(chǎn)和最終的細(xì)胞死亡；Serkan Sertel等[7]經(jīng)基因檢測得出5356的基因包含一個或多個結(jié)合位點的c-Myc/最大的上游該基因的位置，結(jié)論是c-myc和最大介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄控制基因表達(dá)可能有助于提高青蒿琥酯對癌細(xì)胞的治療效果；Wai等[8]提出ART相關(guān)的化合物具有強(qiáng)效

性與細(xì)胞周期相關(guān)；梅昕等[9]采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶聯(lián)反應(yīng)與酶聯(lián)免疫吸附法檢測得出青蒿琥酯可能通過抗炎及調(diào)節(jié)Treg/Th17平衡而發(fā)揮免疫作用；黃偉煒等[10]經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)試驗發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯可明顯抑制結(jié)腸癌HCT-8細(xì)胞的侵襲，其作用機(jī)制可能與其下調(diào)ICAM-1、VEGF165和Ang-2蛋白表達(dá)有關(guān)；朱天明等[11]提出青蒿琥酯能夠抑制人胃癌細(xì)胞GC-7901的增殖，促進(jìn)其凋亡，Caspase 3蛋白的高表達(dá)在促進(jìn)SGC-7901細(xì)胞凋亡中起著重要作用；劉亮等[12]研究表明Art誘導(dǎo)Ec9706細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能是通過降低細(xì)胞線粒體膜電位，啟動內(nèi)源性線粒體凋亡途徑，激活Caspase-3蛋白，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；孫雅潔等[13]采用四甲基偶氮唑鹽法測定青蒿素、雙氫青蒿素、蒿甲醚和青蒿琥酯體外抑制人肺癌細(xì)胞、人胃癌細(xì)胞、人結(jié)腸癌細(xì)胞、人紅白血病細(xì)胞和人肝癌細(xì)胞的活性，認(rèn)為青蒿素及其衍生物在體外對不同的腫瘤細(xì)胞有抑制活性作用；吳理茂等[14]檢測青蒿琥酯對拓?fù)洚悩?gòu)酶的影響顯示，青蒿琥酯能提高DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性，隨著濃度的提高作用漸趨明顯。本實驗通過運用不同濃度的青蒿琥酯干預(yù)兩種不同的人結(jié)腸癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其能抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖。其抑制效應(yīng)隨著劑量增加而逐漸增強(qiáng)，60 μg/mL濃度的青蒿琥酯處理人結(jié)腸癌HCT116和HT29細(xì)胞48 h后抑制率可達(dá)74%左右，呈劑量依賴效應(yīng)。青蒿琥酯作用HCT116和HT29細(xì)胞48 h后兩種胃癌細(xì)胞的IC50值分別為57.34、26.64 μg/mL。表明青蒿琥酯對分化程度較低的人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116抑制作用較為明顯。運用流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示藥物處理24 h后兩種人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡率逐漸上升，呈劑量依賴效應(yīng)，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 不同濃度青蒿琥酯處理兩種人結(jié)腸癌細(xì)胞24 h后的細(xì)胞凋亡率 %

圖1 HCT116細(xì)胞陰性對照

圖2 HCT116細(xì)胞30 μg/mL

圖3 HCT116細(xì)胞60 μg/mL

圖4 HT29細(xì)胞陰性對照

圖5 HT29細(xì)胞30 μg/mL

圖6 HT29細(xì)胞60 μg/mL

青蒿琥酯不但在抑制癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡方面方面廣受關(guān)注，而且還有報道指出青蒿琥酯可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥等作用[15-16]。術(shù)后化療現(xiàn)在仍作為治療中晚期結(jié)腸癌必不可缺的治療手段之一，而現(xiàn)在腫瘤藥物耐藥性及副作用日趨明顯，本試驗通過對青蒿琥酯對人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116和HT29的增殖與凋亡，為青蒿琥酯在臨床抗腫瘤應(yīng)運提供可能，為今后關(guān)于結(jié)腸癌治療的基礎(chǔ)和臨床研究提供一定的思路和方法。

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