李方知 黃廣雄 盧峰岳

胸積液中腺苷脫氨酶（ADA） 活性升高是診斷結(jié)核性胸積液重要的輔助指標之一。ADA有2 種同工酶：ADA1和ADA2。結(jié)核性胸積液ADA活性的升高主要是由ADA同工酶ADA2增高所致，所以ADA2檢測在結(jié)核性胸積液的診斷有重要作用[1]。Ungerer等[2]檢測正常人全身細胞，發(fā)現(xiàn)僅單核巨噬細胞有ADA2。本研究通過檢測結(jié)核性胸腔積液總ADA 和ADA2活性，并用免疫組化方法檢測ADA2在結(jié)核性胸積液胸膜組織細胞中的細胞分布，以進一步了解ADA2的細胞來源和其在結(jié)核性胸積液中的作用機理。

1 資料與方法

1.1 一般資料 32例本院結(jié)核性胸積液患者，經(jīng)細菌學(xué)或病理活檢確診，胸積液性質(zhì)為滲出液。

1.2 方法 紅-9-（2-羥基-3-壬烷基）腺嘌呤（EHNA）能完全抑制ADA1活性，但不能抑制ADA2活性，參照Muraoka等[3]使用的方法，將每份胸積液標本分成2管，第一管直接測量ADA活性，即為總ADA（ADA1＋ADA2），第二管加入EHNA后測量所得的ADA活性為ADA2活性，采用邁克公司腺苷脫氨酶（ADA）檢測試劑盒，羅氏P80自動生化儀測定；ADA2（也稱為CECR1）兔抗人多克隆抗體購自Sigma公司，巨噬細胞表面標志物CD68兔抗人多克隆抗體購自博士德公司，辣根過氧化酶標記Envision二步法二抗，購自Dako公司。以免疫組化（Envision二步法）作結(jié)核性胸積液胸膜組織的ADA2和巨噬細胞表面標志物CD68的免疫組化：同一蠟塊組織以3 μm間距連切兩份，一份以ADA2抗體為一抗工作液作實驗對象，另一份以巨噬細胞表面標志物CD68抗體代替ADA2抗體作為一抗的免疫組化為陽性對照。

1.3 陽性判斷標準 實驗結(jié)果判定以胞質(zhì)內(nèi)和胞膜上出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。用PBS代替ADA2抗體作為一抗的免疫組化為陰性對照。CD68抗體代替ADA2抗體作為一抗的免疫組化為陽性對照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料以（x-±s）表示，比較采用t檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者ADA1與ADA2情況比較 患者結(jié)核性胸積液中總ADA 為（51.88±23.02）U/L，ADA1為（13.04±7.94）U/L，ADA2為（38.84±18.71），ADA2活性占總 ADA的 74.8%，ADA2活性高于ADA1，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=8.48，P<0.01)。

圖2 胸膜結(jié)核ADA2免疫組化（×100）注：黑箭頭所指為朗格漢斯巨細胞

圖1 胸膜結(jié)核的ADA2免疫組化（×200）注：黑箭頭所指為朗格漢斯巨細胞，白箭頭所指為上皮樣細胞

2.2 結(jié)核性胸積液活檢的胸膜組織免疫組化結(jié)果 PBS代替一抗（ADA2抗體）免疫組化的陰性對照，顯示胸膜組織的各種細胞無棕黃色顆粒沉著。結(jié)核性胸積液胸膜組織的ADA2免疫組化（圖1），可見巨噬細胞、朗格漢斯巨細胞和上皮樣細胞被深染，胞漿和胞膜有大量的棕黃色沉著，淋巴細胞、成纖維細胞和其他細胞無棕黃色沉著；結(jié)核性胸積液胸膜組織的ADA2（圖2）和巨噬細胞表面標志物CD68（圖3）的免疫組化均可見巨噬細胞、朗格漢斯巨細胞和上皮樣細胞被深染，胞漿和胞膜有大量的棕黃色沉著，其他細胞無棕黃色沉著。圖2和圖3的染色效果相似。

圖3 胸膜結(jié)核CD68免疫組化（×100）注：黑箭頭所指為朗格漢斯巨細胞

3 討論

本研究顯示結(jié)核性胸腔積液總ADA活性中，ADA2平均占74.8%，其總ADA活性主要是由ADA2所構(gòu)成，提示結(jié)核性胸腔積液總ADA活性升高主要由ADA2所致。胸膜組織ADA2免疫組化結(jié)果和巨噬細胞表面標志物CD68免疫組化結(jié)果相似，巨噬細胞、朗格漢斯巨細胞和上皮樣細胞被深染棕黃色，顯示ADA2來源于巨噬細胞、上皮樣細胞和朗格漢斯巨細胞。結(jié)核性炎癥滲出的細胞常以單核細胞為主，單核細胞經(jīng)血管進入組織后演變?yōu)榫奘杉毎?，活化的巨噬細胞吞食消化結(jié)核分枝桿菌后轉(zhuǎn)化而成上皮樣細胞，多個上皮樣細胞融合成朗格漢斯巨細胞，而結(jié)核菌的菌體脂質(zhì)促使巨噬細胞轉(zhuǎn)變成上皮樣細胞和朗格漢斯巨細胞，所以這些細胞都屬同一細胞來源[4]。Zavialov等[5]報道單核細胞轉(zhuǎn)化為巨噬細胞時會產(chǎn)生ADA；而在炎癥反應(yīng)時，巨噬細胞能分泌AD。

2ADA2能誘導(dǎo)單核細胞分化成巨噬細胞，并且使巨噬細胞和CD4+T細胞增殖，另一種同功酶ADA1則不能誘導(dǎo)單核細胞分化成巨噬細胞，在結(jié)核性胸積液中含有大量的巨噬細胞和CD4+T細胞[7]，宿主抗結(jié)核免疫主要是通過以T淋巴細胞介導(dǎo)、巨噬細胞為效應(yīng)的細胞免疫反應(yīng)，所以ADA2使巨噬細胞和CD4+T細胞增殖的作用可能有利于機體抗結(jié)核。結(jié)核性胸積液ADA2活性升高主要是由于宿主單核巨噬細胞、上皮樣細胞、朗格漢斯巨細胞等和結(jié)核菌相互作用的結(jié)果。

綜上所述，結(jié)核性胸積液的ADA活性主要由ADA2構(gòu)成，ADA2源自巨噬細胞、上皮樣細胞和朗格漢斯巨細胞。

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