楊坦

糖尿病（diabetes mellitus，DM）和阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是臨床上常見的慢性疾病[1-2]。阿爾茨海默病是以學(xué)習(xí)能力退化、記憶喪失和紊亂為特征的神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，而糖尿病常出現(xiàn)廣泛的并發(fā)癥，包括外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害[3-6]。阿爾茨海默病與糖尿病的關(guān)聯(lián)受到越來越多的關(guān)注，據(jù)報(bào)道糖尿病患者患阿爾茨海默病的風(fēng)險(xiǎn)增高[7]。胰島素失調(diào)導(dǎo)致腦內(nèi)信號(hào)分子紊亂，伴隨著出現(xiàn)認(rèn)知障礙，但糖尿病學(xué)習(xí)記憶損傷的具體機(jī)制不明。海馬是關(guān)聯(lián)學(xué)習(xí)記憶功能以及神經(jīng)系統(tǒng)重大疾病的重要結(jié)構(gòu)，長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（Long-term potentiation，LTP）一直被認(rèn)為是海馬參與學(xué)習(xí)記憶的基礎(chǔ)方式[8]。肉桂（Cinnamomum cassia，CE）是臨床中廣泛應(yīng)用的傳統(tǒng)中藥，具有補(bǔ)火助陽，引火歸源，散寒止痛，活血通經(jīng)的功效，神農(nóng)本草經(jīng)中將其譽(yù)為上品。近年來的研究發(fā)現(xiàn)肉桂具有抗糖尿病、抗氧化、抗炎的作用[9]。本文通過建立糖尿病模型，觀察肉桂對(duì)糖尿病大鼠海馬突觸可塑性的影響，并探討其潛在機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 肉桂（產(chǎn)地：越南）購(gòu)自河南省南陽市濟(jì)康醫(yī)藥公司，粉碎機(jī)100目粉碎后備用；鏈脲菌素（streptozotocin，STZ）購(gòu)于Sigma公司；BCA蛋白定量試劑盒（武漢博士德公司）；N-甲基-D-天門冬氨酸受體2B亞型（NMDAR2B，NR2B）抗體及GAPDH抗體購(gòu)自CST公司。江灣I-C型立體定向儀（第二軍醫(yī)大學(xué)器材處），RM6240B型多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)（成都儀器廠），電泳儀及westernblot設(shè)備（Bio-Rad公司），不銹鋼雙極同芯電極（自制）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理方法 27只SD雄性大鼠，體重160~200 g，來自南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。按隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為對(duì)照組、糖尿病組和肉桂組，每組9只。糖尿病組和肉桂組采用一次性腹腔注射STZ（65 mg/kg），注射用STZ配于0.1 mol/L檸檬酸緩沖液（pH 4.5），對(duì)照組注射同劑量的檸檬酸緩沖液。肉桂粉和生理鹽水混合，肉桂組每天按照5 g/kg的劑量通過灌胃添加肉桂粉。28 d后開始斷尾采血進(jìn)行血糖測(cè)試，糖尿病組大鼠空腹血糖水平高于11 mmol/L，之后開始電生理實(shí)驗(yàn)，糖尿病組有2只大鼠在實(shí)驗(yàn)過程中死亡，死亡大鼠數(shù)據(jù)不列入統(tǒng)計(jì)。

1.3 海馬CA1區(qū)細(xì)胞外電位記錄 電生理測(cè)定的方法及參數(shù)同文獻(xiàn)[10]，刺激電極置于Schaffer側(cè)支，記錄電極在海馬CA1區(qū)，單刺激誘導(dǎo)海馬CA1區(qū)群體鋒電位（Population spike，PS）。強(qiáng)直刺激誘發(fā)LTP。再給予單刺激2 h以上。記錄強(qiáng)直刺激前后CA1區(qū)電位波形，用PS幅度作為評(píng)測(cè)指標(biāo)，PS增幅=（強(qiáng)直刺激后PS幅度/強(qiáng)直刺激前PS幅度）×100%。

1.4 westernblot蛋白印跡檢測(cè) 在電生理測(cè)定之后處死動(dòng)物，取海馬組織在裂解液中冰上裂解，離心機(jī)離心10 min（12 000 g，4 ℃），取上清液，通過BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量測(cè)試，使單位樣品蛋白總量保持一致，5%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺（SDS）凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，于含5%牛血清蛋白（BSA）TBS-T溶液中室溫封閉2 h，含NR2B或GAPDH的抗體的TBS-T溶液（1∶1000）4 ℃孵化過夜，TBS-T溶液洗膜3次，每次10 min，堿性磷酸酶（AP）標(biāo)記的山羊抗兔抗體中室溫孵化1 h，重復(fù)洗膜3次，氯化硝基四氮唑蘭（Nitroblue tetrazolium chloride，NBT）/5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽（5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate，BCIP）顯色液顯色，掃描的圖像用Quantity one 1.0軟件進(jìn)行灰度值分析，NR2B相對(duì)蛋白水平用GAPDH做參照。

圖1 各組強(qiáng)直刺激前后PS幅度變化注：a：各組強(qiáng)直刺激前后PS變化描記圖；b：各組強(qiáng)直刺激前后場(chǎng)電位變化百分?jǐn)?shù)，以強(qiáng)直刺激前30 min PS幅度平均值為100%，在橫坐標(biāo)上0時(shí)進(jìn)行強(qiáng)直刺激

圖2 各組海馬腦組織中NR2B的表達(dá)注：a：NR2B在海馬腦組織中的表達(dá)western-blot條帶原始圖例；b：westernblot方法測(cè)定NR2B表達(dá)量的比值，以對(duì)照組平均表達(dá)量為1。*與糖尿病組相比，P<0.05

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS 19.0軟件，Excel軟件用于作圖。所得數(shù)據(jù)均用（±s）表示，進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 海馬腦電記錄 單刺激Schaffer側(cè)支纖維在25只大鼠海馬CA1區(qū)均記錄到幅度穩(wěn)定的PS，平均幅度為（39.75±4.18）μV。對(duì)照組9只大鼠強(qiáng)直刺激后5 min開始觀察到PS幅度增大至強(qiáng)直刺激前平均值的（195.46±3.87）%，最大增幅出現(xiàn)在強(qiáng)直刺激后90 min，為強(qiáng)直刺激前PS平均值的（257.15±3.64）%，這種突觸傳遞效能的增強(qiáng)可維持2 h以上，即誘導(dǎo)出海馬CA1區(qū)LTP。強(qiáng)直刺激前后PS幅值的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。糖尿病組7只大鼠強(qiáng)直刺激后PS平均增幅為（122.97±2.11）%，明顯低于對(duì)照組的平均增幅（235.03±3.84）%（P<0.05），結(jié)果顯示糖尿病大鼠海馬CA1區(qū)的LTP明顯抑制。肉桂組9只大鼠強(qiáng)直刺激后PS平均增幅為（188.83±3.02）%，明顯高于糖尿病組（P<0.05），強(qiáng)直刺激前后海馬PS變化見圖1。

2.2 海馬NR2B的表達(dá) 研究肉桂改變糖尿病大鼠突觸可塑性變化的機(jī)制，實(shí)驗(yàn)用westernblot的方法檢測(cè)海馬組織中NR2B的表達(dá)，如圖2所示，糖尿病組海馬NR2B的表達(dá)量明顯下降（P<0.05），平均相對(duì)表達(dá)量為對(duì)照組的60.54%。相對(duì)于糖尿病組，肉桂組NR2B的表達(dá)量明顯升高（P<0.05），為對(duì)照組的84.77%。

3 討論

糖尿病患者的學(xué)習(xí)記憶功能的下降受到越來越多的關(guān)注，以往大量研究表明學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵部位在海馬，而突觸可塑性變化被認(rèn)為是海馬參與學(xué)習(xí)記憶的基本形式[11]。海馬突觸可塑性變化主要包括長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)和長(zhǎng)時(shí)程抑制，自從發(fā)現(xiàn)LTP現(xiàn)象以來，由于其具有時(shí)程長(zhǎng)和聯(lián)合的特性，人們認(rèn)為這種突觸傳遞效能的增強(qiáng)是海馬將短時(shí)記憶轉(zhuǎn)化為長(zhǎng)時(shí)記憶的生物學(xué)基礎(chǔ)。研究表明，阻斷海馬LTP會(huì)導(dǎo)致空間學(xué)習(xí)記憶能力下降，而增強(qiáng)LTP具有促進(jìn)記憶的功效[12]。晚時(shí)相LTP的產(chǎn)生需要腦內(nèi)信號(hào)分子的介導(dǎo)，海馬LTP現(xiàn)象大多與NMDA受體有關(guān)，NMDA受體由NR1、NR2和NR3亞基組成，在不同腦區(qū)亞基表達(dá)不同，成年動(dòng)物海馬CA1區(qū)表達(dá)主要為NR2B型亞基，NR2B基因敲除小鼠表現(xiàn)為突觸可塑性和學(xué)習(xí)記憶功能的下降，而超表達(dá)NR2B基因則表現(xiàn)為突觸可塑性和學(xué)習(xí)記憶能力的增強(qiáng)[13]。有報(bào)道稱糖尿病大鼠的認(rèn)知障礙與NMDA受體有關(guān)，應(yīng)用NMDA受體激動(dòng)劑可改善糖尿病大鼠的認(rèn)知障礙[14]。本次實(shí)驗(yàn)中，糖尿病大鼠的海馬CA1區(qū)LTP抑制的同時(shí)伴有腦內(nèi)NR2B表達(dá)的減少，表明糖尿病導(dǎo)致的突觸可塑性下降與其海馬NR2B表達(dá)的抑制有關(guān)。

肉桂主要成分為桂皮醛（cinnamaldehyde），占52.92%~61.20%，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為肉桂具有補(bǔ)火助陽、溫里散寒、祛風(fēng)散寒、溫陽行氣、溫經(jīng)通脈等功效，近來的研究表明肉桂具有抗氧化、抗糖尿病的作用。有研究稱，肉桂提取物可使糖耐量保持正常并增強(qiáng)機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)均表明肉桂有直接的抗糖尿病的作用[15]。有研究報(bào)道肉桂能提高腦組織超氧化物歧化酶活性及神經(jīng)生長(zhǎng)因子、腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子的表達(dá)，降低丙二醛含量，改善慢性腦缺血大鼠的認(rèn)知能力[16]。本次實(shí)驗(yàn)中，肉桂明顯改善糖尿病大鼠的LTP的抑制現(xiàn)象，提高海馬突觸可塑性，有效改善糖尿病大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的下降，同時(shí)，應(yīng)用肉桂治療后，糖尿病大鼠海馬NR2B的表達(dá)增多。這一系列結(jié)果表明肉桂改善糖尿病大鼠學(xué)習(xí)記憶和突觸可塑性與其上調(diào)海馬NR2B的表達(dá)有關(guān)。

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