張珊珊 杜震生 陳峰 蘇寧

目前，隨著人民生活質(zhì)量意識提高，周圍神經(jīng)損傷后恢復(fù)日益受到重視。雖然顯微外科手術(shù)可以解除周圍神經(jīng)卡壓，但如何保護卡壓神經(jīng)，最大限度地減輕繼發(fā)性損害，重建神經(jīng)傳導(dǎo)，當前還無法很好解決。近年來，運用物理療法治療周圍神經(jīng)損傷已有報道[1-4]，但治療機制仍不清楚，基于此，本課題采用經(jīng)典Mackinnon[5]大鼠坐骨神經(jīng)卡壓模型，采用康復(fù)訓(xùn)練聯(lián)合針刺療法，通過對卡壓神經(jīng)CD34、VEGF表達檢測以及坐骨神經(jīng)功能指數(shù)檢測，分析、揭示康復(fù)訓(xùn)練聯(lián)合針刺療法對卡壓周圍神經(jīng)微血管生成及功能修復(fù)的作用機制，為臨床從神經(jīng)微循環(huán)角度治療神經(jīng)損傷提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用雄性清潔級SD大鼠46只（由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供），體質(zhì)量230~250 g。

1.2 主要試劑 小鼠抗大鼠VEGF單抗：武漢博士德生物技術(shù)有限公司。SABC免疫組化染色試劑盒：武漢博士德生物技術(shù)有限公司。兔抗大鼠CD34多克隆抗體：武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

DAB顯色試劑盒：武漢博士德生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器設(shè)備 顯微手術(shù)器械：浙江寧波市成和顯微器械廠；醫(yī)用硅膠管：上海橡膠制品五廠；FS3013德國目樂顯微鏡：德國麥迪塞姆儀器有限公司；圖像采集系統(tǒng)，Image Pro Pluss 5.01；G6805型電針儀：上海醫(yī)療器械高科技公司。

1.4 動物模型制作 動物模型參照經(jīng)典Mackinnon大鼠坐骨神經(jīng)卡壓模型制作。模型實驗動物于同一動物飼養(yǎng)室適宜環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。在梨狀肌下緣10 mm處，將內(nèi)徑1.0 mm、長6.0 mm的一段硅膠管縱向切開后套在這段坐骨神經(jīng)上，以7/0無創(chuàng)線在8倍手術(shù)顯微鏡下縫合硅膠管3針。術(shù)后2周，隨機選6只，沿原切口打開，卡壓段神經(jīng)經(jīng)病理學(xué)證實為中、重度脫髓鞘改變，則造模成功。造模成功后，其余40只大鼠僅去除硅膠管，卡壓段神經(jīng)外膜不加以松解。

1.5 動物分組 動物模型隨機等分為4組（n=10）。A組（對照組）：僅去除卡壓；B組（康復(fù)訓(xùn)練組）：去除卡壓后行康復(fù)訓(xùn)練；C組（電針組）：去除卡壓后行電針治療；D組（康復(fù)訓(xùn)練+電針組）：去除卡壓后行康復(fù)訓(xùn)練加電針治療。

1.6 治療方法

1.6.1 康復(fù)訓(xùn)練 手術(shù)結(jié)束后第2周開始康復(fù)訓(xùn)練，訓(xùn)練項目為游泳，每天1次，第1天10 min，每天增加3 min，直到手術(shù)結(jié)束后第3周增至30 min，之后不再增加維持至實驗結(jié)束取材為止。

1.6.2 電針治療 電針治療于去除卡壓術(shù)后第2天開始，在支架上固定，按實驗針灸學(xué)穴位定位，電針正極接在近心端，負極接在遠心端。分別夾在“足三里”和“環(huán)跳”穴處的針柄上。用華佗牌0.25 mm、13 mm的針灸針進針6 mm，針灸方法為電針，采用G6805型電針儀，雙向規(guī)律電脈沖，寬度0.5 ms，頻率2 Hz，穴位周圍組織達到輕度顫抖即可。治療時間為20 min，每天1次，維持至手術(shù)結(jié)束后第3周實驗結(jié)束。

1.7 觀察項目

1.7.1 整體狀態(tài) 解除卡壓手術(shù)結(jié)束后觀測大鼠的肢體、傷口恢復(fù)情況。

1.7.2 坐骨神經(jīng)功能指數(shù)（Sciatic nerve function index，SFI）測評 參照沈?qū)幗萚6]的方法，正常：SFI=0；完全損傷：-100；不完全損傷：-100至0。測量時間為去除卡壓手術(shù)結(jié)束后第22天。

1.7.3 CD34、VEGF檢測 取卡壓神經(jīng)中段標本石蠟切片，采用免疫組化染色，用以判定CD34、VEGF免疫組化水平表達程度。CD34、VEGF染色成棕黃色至深棕色為陽性，神經(jīng)微血管密度（MVD）計算參照Weidner[7]方法。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)均錄入SPSS 18.0軟件完成統(tǒng)計分析。所有計量資料均先進行單樣本K-S正態(tài)分布檢驗及方差齊性檢驗，屬正態(tài)分布且方差齊的多組獨立樣本比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），如屬于非正態(tài)分布或方差不齊的多組獨立樣本比較進行非參數(shù)檢驗（秩和檢驗）中K個獨立樣本檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 整體狀態(tài) 兩組大鼠均少數(shù)出現(xiàn)右爪皮膚潰瘍，但D組潰瘍愈合程度好于B組與C組，A組愈合程度最差；肌肉萎縮方面，D組肌肉萎縮程度低于B組與C組，A組肌肉萎縮最明顯；打開切口均可見神經(jīng)卡壓處變細，質(zhì)地變硬，與周圍組織粘連，卡壓處兩端增粗，但D組好于B組與C組，A組最差。

2.2 各組大鼠坐骨神經(jīng)功能指數(shù)（SFI）測評比較 B、C、D組SFI恢復(fù)程度均大于A組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；D組SFI恢復(fù)程度明顯大于B組與C組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.3 各組大鼠CD34檢測比較 B、C、D組再生神經(jīng)微血管數(shù)量明顯高于A組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；D組再生神經(jīng)微血管數(shù)量明顯高于B組與C組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.4 各組血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）檢測比較 B、C、D組VEGF表達明顯高于A組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；D組VEGF表達明顯高于B組與C組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見表1。

表1 各組大鼠SFI比較（±s）

表1 各組大鼠SFI比較（±s）

*與A組比較，P<0.05；△與B組比較，P<0.05；﹟與C組比較，P<0.05

組別 SFI CD34 VEGF A組（n=10） -28.74±4.00 27.99±3.92 25.64±3.94 B組（n=10） -21.27±3.80* 33.65±3.04* 32.49±4.43*C組（n=10） -21.58±3.65* 32.16±3.50* 30.39±4.48*D 組（n=10） -15.93±2.68*△﹟ 37.39±4.54*△﹟ 39.12±4.46*△﹟

3 討論

CD34是一種跨膜細胞表面糖蛋白，是小血管內(nèi)皮細胞、內(nèi)皮細胞祖細胞和造血祖細胞表面的標志[8]，常用CD34標記新生血管，因其抗體是毛細血管的內(nèi)皮細胞標記物[9]。

血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是一種作用較強的血管生成因子和高度特異的促血管內(nèi)皮有絲分裂因子，同時還是神經(jīng)營養(yǎng)因子。Gupta等[10]發(fā)現(xiàn)慢性受壓神經(jīng)內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子及其受體蛋白增多，神經(jīng)內(nèi)血管數(shù)目會同時上升。在缺血性損傷情況下，Wang等[11]與Zachary[12]研究表明VEGF能夠大幅提高血管再生。

血液供應(yīng)是神經(jīng)再生與功能恢復(fù)的前提，眾所周知，運動訓(xùn)練可改善血液供應(yīng)，進而促進了神經(jīng)再生與恢復(fù)[13-16]。大鼠運動療法本實驗采用游泳訓(xùn)練。一方面，水靜壓可以消除腫脹，促進肌肉恢復(fù)，進而促進靶器官神經(jīng)功能。另一方面，浮力作用可使身體負荷減輕，從而減輕腿部疼痛，使運動變得更容易，更增強了運動療效。多項研究顯示，在治療周圍神經(jīng)損傷、促進神經(jīng)再生、恢復(fù)神經(jīng)功能方面，電針有較明顯優(yōu)勢[17-20]。

本研究表明綜合康復(fù)能夠有效促進大鼠卡壓坐骨神經(jīng)再生，同時促進神經(jīng)功能恢復(fù)，這可能與神經(jīng)內(nèi)微血管再生有關(guān)。

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