湛孝東 李朝品 席貽龍

螨類是一種體型微小的節(jié)肢動(dòng)物，在分類上屬于蛛形綱（Arachnida）、蜱螨亞綱（Acari）的寄螨目（Parasitiformes）和真螨目（Acariformes）[1]。螨體大小一般都在0.5 mm左右，有些小到0.1 mm，大多數(shù)種類小于1 mm。其種類和分布都及其廣泛，現(xiàn)在研究較多的是農(nóng)業(yè)螨類和醫(yī)學(xué)螨類，前者如葉螨，后者如塵螨等[2]。塵螨的分泌物和死亡螨體的崩解物是一種重要的過(guò)敏原，可引起過(guò)敏性皮炎、過(guò)敏性哮喘等疾病[3-5]。因目前大多數(shù)螨類都存在抗藥性的問(wèn)題，所以藥物防制較為困難，目前在螨類的防制上遺傳防制是目前研究的熱點(diǎn)[6-7]。而研究螨類的分子進(jìn)化時(shí)常需要提取單頭螨類的線粒體基因組，因螨類個(gè)體微小，單頭螨DNA的提取極其困難[8]，筆者比較了文獻(xiàn)介紹的幾種常用的提取方法，用PCR擴(kuò)增單頭螨的線粒體COⅠ基因，結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 Chelex-100 （Sigma，C7901）、平衡酚（pH 6.7~7.8）、氯仿 -異戊醇（24∶1）、無(wú)水乙醇、醋酸鈉、1×TE液緩沖液、蛋白酶K（>600 U/mL，Thermo）、勻漿緩沖液、研磨緩沖液（STE）、10×Buffer（Mg2+Free）、MgCl2（25 mmol/L）、dNTP Mixture（20 mmol/mL）、Taq 酶（5 U/μL）、DNA marker均購(gòu)自上海生工。COⅠ引物（正向：5’-GTTTTGGGATATCTCTCATAC-3’， 反 向：5’-GAGCAACAACATAATAAGTATC-3’）由上海生工合成。

1.2 主要儀器 PCR儀（ABI2720）、高速冷凍離心機(jī)（Beckman）、水平電泳儀（Bio-Rad）、凝膠電泳成像分析系統(tǒng)（SYNGENE）。

1.3 總DNA提取方法

1.3.1 Chelex-100抽提法 取活螨體（腐食酪螨Tyrophagus putrescentiae）用滅菌雙蒸水清洗凈后置于潔凈濾紙上干燥，然后用滅菌針挑取單頭螨置于含有0.5 mL 雙蒸水的1.5 mL離心管中，用滅菌研磨棒充分研磨后加雙蒸水0.5 mL，旋渦混勻，置-20 ℃冰箱冷凍10 min，12 000 r/min離心5 min，棄上清。重復(fù)洗滌2~3次；沉淀中加入150 μL預(yù)先懸浮好的5%的Chelex-100溶液。56 ℃水浴2 h，旋渦混勻10 s。置100 ℃加熱10 min，取出后漩渦混勻10 s，10 000 r/min離心5 min，上清液即可作為PCR反應(yīng)的模板[9]。

1.3.2 酚氯仿抽提法 取單頭螨體樣本放入含0.6 mL勻漿緩沖液的1.5 mL離心管中，用玻璃研磨棒充分研磨。37 ℃水浴1~3 h，直至勻漿緩沖液變清澈為止。在勻漿緩沖液中加入相同體積的平衡酚，緩慢上下顛倒10次，然后6000 r/min離心10 min，保留上清液。重復(fù)上述步驟直到酚相與水相的界面處白色蛋白質(zhì)層消失，保留上清液，再加入等體積的氯仿：異戊醇溶液，緩慢上下顛倒10次，再8000 r/min離心10 min，保留上清液，再加入2×體積的-20 ℃無(wú)水乙醇沉淀DNA。4 ℃冰箱內(nèi)放置10 min后，12 000 r/min離心10 min，棄上清液。在沉淀中加入1 mL 70%的冷乙醇洗滌DNA，10 000 r/min離心5 min，棄上清。自然干燥后加滅菌雙蒸水溶解作為PCR反應(yīng)的模板[10]。

1.3.3 蛋白酶K法 取單頭螨體樣品放入0.2 mL離心管中，加入30 μL的STE研磨緩沖液，用燒溶后的槍頭將螨體充分研磨后，用30 μL STE研磨緩沖液清洗槍頭，加入蛋白酶K（200 μg/mL），研磨液56 ℃消化1~2 h，消化后的產(chǎn)物95 ℃ 保溫45 s，2000~3000 r/min離心30 s，上清液作為做PCR反應(yīng)的模板[11]。

1.4 PCR反 應(yīng) PCR反 應(yīng) 體 系（27 μL）：10×Buffer（Mg2+Free） 2.5 μL，mg2+2.0 μL，dNTP Mixture 0.2 μL，正反引物（10 pmo1）各0.5 μL，Taq酶0.5 μL，加雙蒸水至27 μL。PCR擴(kuò)增條件如下：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸 30 s，運(yùn)行35 個(gè)循環(huán)。72 ℃后延伸10 min。

1.5 PCR反應(yīng)產(chǎn)物檢測(cè) 每個(gè)樣本取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳（90 V，40 min），結(jié)果用凝膠電泳成像分析系統(tǒng)拍照。

2 結(jié)果

COⅠ基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示：酚氯仿法未能從單頭螨中提取到有效DNA，而蛋白酶K法和Chelex-100法則獲得電泳條帶（圖1），分子量約為380 bp，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果的一致，表明成功擴(kuò)增出了目標(biāo)條帶。說(shuō)明蛋白酶K法和Chelex-100法可抽提到適于PCR反應(yīng)的DNA模板量。蛋白酶K法的條帶較Chelex-100法清晰明亮，說(shuō)明蛋白酶K法提取效果優(yōu)于Chelex-100法。但Chelex-100法可獲得約150 μL的模板，而蛋白酶K法只能獲得約20 μL模板。

圖1 不同提取方法COⅠPCR產(chǎn)物電泳結(jié)果M：DNA Marker；1：酚氯仿法；2：蛋白酶K法；3：Chelex-100法

3 討論

本研究選取的腐食酪螨是我國(guó)常見的儲(chǔ)藏物螨類之一。該螨常孳生在儲(chǔ)藏糧食、飼料和中藥材中，不僅可造成儲(chǔ)藏物數(shù)量損失，也能導(dǎo)致儲(chǔ)藏物品質(zhì)下降，對(duì)人類健康和環(huán)境造成嚴(yán)重威脅。該螨個(gè)體小、繁殖量大、生活史周期短，分布廣泛。隨著儲(chǔ)糧保護(hù)劑和熏蒸劑的大量、持續(xù)使用，耐藥性和抗藥水平不斷提高，增加了其防制難度。因而，研究腐食酪螨的系統(tǒng)發(fā)育可為該螨的防制提供分子水平的依據(jù)。

線粒體是真核生物細(xì)胞中由雙層高度特化的單位膜圍成的細(xì)胞器，其主要功能是通過(guò)氧化磷酸化作用合成ATP，為細(xì)胞各種生理活動(dòng)提供能量。線粒體的一個(gè)顯著特點(diǎn)是具有自身的DNA和遺傳體系。自20世紀(jì)60年代線粒體基因組發(fā)現(xiàn)以來(lái)，由于其分子量相對(duì)較小、呈母系遺傳、突變率高及在細(xì)胞中拷貝多等特點(diǎn)[12]，受到了進(jìn)化生物學(xué)家們的格外青睞，被廣泛用于種群遺傳學(xué)、譜系地理學(xué)、分子進(jìn)化、種系發(fā)生和比較及進(jìn)化基因組學(xué)等多方面的研究[13]，極大地加深了人們對(duì)物種進(jìn)化現(xiàn)象、過(guò)程及機(jī)制的理解。近年來(lái)，隨著技術(shù)的日趨成熟以及新一代測(cè)序技術(shù)的興起，越來(lái)越多的后生動(dòng)物的線粒體基因組的測(cè)序工作得以完成[14]。線粒體基因組不僅比單個(gè)線粒體基因包含更多的序列信息，而且具有一系列基因組水平的特征，如基因排序、RNA基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)以及復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的控制模式等[15]。因此，線粒體基因組作為GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中數(shù)量最多的“全”基因組序列，為系統(tǒng)發(fā)育框架下解析后生動(dòng)物基因組的進(jìn)化機(jī)制提供了很好的材料。

目前線粒體基因已廣泛用于真螨總目螨類的系統(tǒng)發(fā)育研究中，常見的mtDNA 基因有rrnS，rrnL 和cox1 基因等，為理解真螨總目螨類各類群之間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系提供新證據(jù)。例如，基于線粒體cox1 基因和核18S rDNA 基因序列對(duì)真螨總目螨類進(jìn)行首次全面系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明真螨總目為一單系群，且真螨總目下分為疥螨目（Sarcoptiformes）和絨螨目（Trombidiformes），其中疥螨目由內(nèi)氣門亞目（Endeostigmata）和甲螨亞目（Oribatida）+無(wú)氣門亞目（Astigmata）組成[15]。另一方面，僅依據(jù)單個(gè)或少數(shù)幾個(gè)分子標(biāo)記，以及不同的單個(gè)基因間得出的結(jié)論存在差異等均可能降低其結(jié)果的可靠性。目前，基于線粒體基因組序列進(jìn)行的系統(tǒng)發(fā)育研究主要集中在節(jié)肢動(dòng)物高級(jí)分類階元如綱、總目、目之間[16]，但有關(guān)真螨總目螨類的研究較少。Domes等[17]基于線粒體基因組13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因?qū)σ褱y(cè)的26種節(jié)肢動(dòng)物進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系分析，其中真螨總目涉及種類很少，僅2個(gè)亞目4個(gè)種類，即前氣門亞目和甲螨亞目。因此，獲得更多真螨總目螨類的線粒體基因組序列顯得頗為迫切。事實(shí)上，在進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育研究時(shí)，線粒體基因組序列表現(xiàn)的一些特征如堿基組成異質(zhì)性和位點(diǎn)間速率變異等，很難正確構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，導(dǎo)致系統(tǒng)偏差。因此，線粒體部分基因或全序列可作為真螨總目螨類系統(tǒng)發(fā)育研究中有效的分子標(biāo)記。

真核生物95%的DNA存在于細(xì)胞核中，其它約5%為細(xì)胞器DNA，存在于線粒體、葉綠體DNA等中[18]。從真核生物中分離提取DNA原則是保證DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性，排除其它雜質(zhì)的污染。因此，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中為了保證所分離DNA純度和完整性，要盡量減少操作步驟，縮短提取過(guò)程，從而可以避免機(jī)械剪切力對(duì)溶液中DNA的破壞和DNAase對(duì)DNA的降解[19-20]。分離提取DNA的基本過(guò)程是將細(xì)胞破碎，從而使得DNA與蛋白質(zhì)分離，然后再純化、濃縮DNA[21-22]。提取成功與否破碎細(xì)胞這一步非常重要，此步驟直接影響到下面的提取步驟和DNA的提取質(zhì)量，勻漿必須非常充分，否則抽提效率降低，甚至導(dǎo)致抽提失敗。本實(shí)驗(yàn)采用滅菌的玻璃研磨棒和燒溶槍頭對(duì)螨體進(jìn)行搗碎、勻漿，取得了非常好的效果。

因螨類個(gè)體微小，所以單頭螨的DNA提取尤其困難，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)最關(guān)鍵的步驟是充分研磨，本研究利用購(gòu)買的特殊玻璃研磨棒（適用于1.5 mL離心管）或燒溶的槍頭（適用于0.2 mL離心管）可以充分貼壁研磨螨體，并在研磨后將玻棒上粘連的組織沖洗至試管中，減少的螨體的損失，保證了DNA的量。此外在抽提過(guò)程中加入冰凍環(huán)節(jié)，可增加DNA的析出率，提高了抽提效率。

Chelex-100是一種由苯乙烯和苯二乙烯組成的一種金屬離子螯合劑，可高選擇性地去除樣品和緩沖液中的金屬離子，避免煮沸過(guò)程中模板DNA的降解。被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)微量血痕DNA以及微生物DNA提取[23-24]。與經(jīng)典的酚氯仿抽提法相比，Chelex-100法未用苯酚除蛋白質(zhì)，也未用乙醇沉淀DNA，所以DNA中仍混有少許蛋白質(zhì)，但PCR反應(yīng)對(duì)模板純度的要求較低，其結(jié)果是穩(wěn)定可靠的，其特異性和敏感性可與酚氯仿法相媲美[25]。Chelex-100法與傳統(tǒng)的酚氯仿抽提法比較，省去了復(fù)雜的抽提純化過(guò)程，節(jié)省了時(shí)間。此外本法單頭螨即可獲得可用于PCR反應(yīng)的模板量，而酚氯仿抽提法在抽提純化過(guò)程中DNA損失量較大，無(wú)法從微量樣品中得到目的DNA。再者，Chelex-100試劑無(wú)毒，而酚和氯仿對(duì)人體有一定的毒性[26]。

蛋白酶K法直接用蛋白酶K消化被充分研磨的極微量樣品，從而得到適合于PCR反應(yīng)的DNA模板。因所需的樣品量極微小，所得的PCR產(chǎn)物經(jīng)進(jìn)一步純化后可以達(dá)到較高的純度，適用于RAPD、RFLP、序列測(cè)定、克隆等試驗(yàn)。該方法除具備Chelex-100法的優(yōu)點(diǎn)外，成本較Chelex-100法低廉，而且提取效率高，但是所獲得的模板量較Chelex-100法少。綜合Chelex-100法和蛋白酶K法各自的優(yōu)缺點(diǎn)，當(dāng)需要大量模板時(shí)可使用Chelex-100法，而只需要獲得少量模板可采用蛋白酶K經(jīng)濟(jì)、快捷。

本實(shí)驗(yàn)采用活體的螨類標(biāo)本，而對(duì)于不同保存方法和不同保存時(shí)間的螨類標(biāo)本，上述3種方法的取提效果還有待進(jìn)一步的研究。

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