殷復(fù)粉，王 寧，于 嘯 ，畢曉寧，徐小惠，王言奎

青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東 青島 266003

宮頸癌細(xì)胞系中HPV16 E6、E7及E6/E7基因?qū)TK31基因甲基化狀態(tài)及表達(dá)的影響

殷復(fù)粉，王 寧，于 嘯 ，畢曉寧，徐小惠，王言奎

青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，山東 青島 266003

背景與目的：絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶31(serine/threonine kinases 31，STK31)基因在人類多種癌癥中扮演重要角色，且STK31基因的表達(dá)受其啟動子及第一外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)的影響；病毒感染與腫瘤組織中某些抑癌基因啟動子區(qū)高甲基化有關(guān)。本研究旨在探討宮頸癌細(xì)胞系中HPV16 E6、E7及E6/E7癌基因?qū)TK31基因甲基化狀態(tài)及表達(dá)的影響，以及不同種類甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)基因在STK31基因甲基化中的潛在作用。方法：構(gòu)建外源性HPV16 E6、E7以及E6/E7基因共表達(dá)慢病毒，分別感染人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)陰性宮頸癌細(xì)胞系HT-3及C33A，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系；采用亞硫酸氫鹽基因組測序法(bisulfite genomic sequencing，BGS)和甲基化特異性PCR (methylation-specific PCR，MSP)檢測3種HPV陽性宮頸癌細(xì)胞系HeLa、SiHa和CasKi以及HPV陰性宮頸癌細(xì)胞系HT-3和C33A轉(zhuǎn)染前后STK31基因的甲基化狀態(tài)；RT-PCR及蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測上述宮頸癌細(xì)胞系中STK31基因的表達(dá)以及DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b和DNMT3L基因在HPV16轉(zhuǎn)染前后宮頸癌細(xì)胞系及HPV陽性、HPV陰性宮頸癌組織中的表達(dá)情況。結(jié)果：外源性HPV16 E6、E7以及E6/E7基因可在HPV陰性宮頸癌細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)。3種HPV陽性細(xì)胞系HeLa、SiHa和CasKi中STK31基因呈低甲基化狀態(tài)，STK31 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)陽性；2種HPV陰性細(xì)胞系HT-3、C33A中STK31基因則表現(xiàn)為高甲基化狀態(tài)，STK31 mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)缺失；與未感染慢病毒HT-3和C33A細(xì)胞系比較，外源性HPV16 E7以及E6/E7表達(dá)的HT-3和C33A細(xì)胞系STK31基因甲基化程度降低，其mRNA及蛋白質(zhì)重新表達(dá)。DNMT1、DNMT3a和DNMT3b基因在HT-3E6/E7和C33AE6/E7細(xì)胞系中mRNA水平分別高于HT-3空載細(xì)胞系和C33A空載細(xì)胞系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。DNMT1、DNMT3a和DNMT3b基因的mRNA水平在HPV16陽性宮頸癌組織中的表達(dá)高于其在HPV陰性宮頸癌組織中的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.997，P＜0.001；t=6.743，P＜0.001；t=7.926，P＜0.001)。DNMT2在HT-3E6/E7和C33AE6/E7細(xì)胞系中mRNA表達(dá)水平分別低于HT-3空載細(xì)胞系和C33A空載細(xì)胞系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.451，P＜0.001；t=2.451，P＜0.05)；DNMT2基因轉(zhuǎn)錄水平在HPV16陽性宮頸癌組織中低于HPV陰性宮頸癌組織(t=9.134，P＜0.001)。DNMT3L mRNA表達(dá)水平在宮頸癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)染前后及HPV陰陽性宮頸癌組織中的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論：HPV感染可導(dǎo)致STK31基因啟動子及第1外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)降低，低甲基化狀態(tài)促進(jìn)該基因表達(dá)。STK31基因的表達(dá)受其啟動子及第1外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)的調(diào)控。HPV16 E7、E6/E7基因可能通過影響DNMT2的表達(dá)參與調(diào)控癌基因STK31基因啟動子及第1外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)。

絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶31基因；甲基化；人乳頭病毒16；宮頸癌；生物標(biāo)志

［Abstract］ Background and purpose: Studies have proved that the serine/threonine kinases 31 (STK31) gene plays important roles in human cancers. The STK31 gene expression was demonstrated to be regulated by the methylation status of its promoter/exon1 region. Viral infection was revealed to be associated with the hypermethylation of some tumor suppressor genes in some tumor samples. The purposes of this paper were to study the roles of HPV16 E6, E7, or E6/ E7 oncogenes in methylation status and expression of the STK31 gene, and potential effects of DNA methyltransferases (DNMTs) on STK31 gene methylation status. Methods: Ectopically-expressed HPV16 E6, E7, or E6/E7 cells were established by transfecting HPV16 E6, E7, or E6/E7 oncogenes with lentivirus vectors into HPV-negative cervical cancer cell lines HT-3 and C33A. Bisulfite genomic sequencing PCR (BGS) combined with TA clone and MSP (methylation-specific PCR) were used to analyze methylation status of the STK31 gene promoter/exon1 region in HPV-positive cervical cancer cell lines (HeLa, SiHa, CaSki), HPV-negative cervical carcinoma cell lines (C33A, HT-3) and the transfected cells. The mRNA and protein expression of STK31, DNMT1, DNMT2, DNMT3a, DNMT3b and DNMT3L were detected by RT-PCR and Western blot. Results: Transfection efficiency was tested by Western blot, which showed that the transfected cells successfully expressed E6, E7, or E6/E7 proteins, respectively. The STK31 gene promoter/exon1 was hypomethylated in HPV-positive cell lines HeLa, SiHa and CasKi resulting in detection of mRNA and protein expression. STK31 gene promoter/exon1 showed hypermethylation leading to silenced expression in the two HPV-negative cervical cancer cells HT-3 and C33A. Compared with primary HT-3 and C33A cells, the methylation status of STK31 promoter/exon1 was down-regulated that led to expression of STK31 in the ectopically-expressed HPV16 E7 and E6/E7 cells. Expressions of DNMT1, DNMT3a and DNMT3b genes at the level of transcription were higher in C33AE6/E7 and HT-3E6/E7 cells than those in C33A-vector and HT-3 vector cells, respectively (P＜0.001). mRNA levels of DNMT1, DNMT3a and DNMT3b were higher in HPV16-positive cervical cancer tissues than those in HPV-negative cervical cancer tissues, respectively (t=5.997, P＜0.001; t=6.743, P＜0.001; t=7.926, P＜0.001). DNMT2 mRNA level was lower in C33AE6/E7 and HT-3E6/E7 cells than those in C33A-vector and HT-3 vector cells, respectively (t=7.451, P＜0.001; t=2.451, P＜0.05). mRNA level of DNMT2 gene was lower in HPV16-positive cervical cancer tissues than in HPV-negative cervical cancer tissues (t=9.134, P＜0.001). There was no statistically significant difference in expression levels of DNMT3L mRNA between cervical cancer cell lines before and after transfection, or HPV16-positive and HPV-negative cervical cancer tissues, respectively (P＞0.05, data not shown). Conclusion: HPV infection leads to the down-regulated methylation status of STK31 promoter/exon1 that results in the expression of STK31. STK31 gene expression is regulated by methylation status of its promoter/exon1 region. HPV16 E7 and E6/E7 oncogenes may influence the methylation status of STK31 gene promoter/exon1 region by regulating the expression of DNMT2.

宮頸癌是女性死亡的主要原因之一，在發(fā)展中國家尤為顯著［1-2］。持續(xù)性高危型人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染與90%宮頸癌相關(guān)，且HPV16型是最常見的高危型HPV，并與世界上60%的宮頸癌相關(guān)［3-4］。大量研究表明，病毒感染與腫瘤組織中抑癌基因啟動子區(qū)高甲基化有關(guān)［5-6］。同樣地，癌基因啟動子區(qū)的異常甲基化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展亦密切相關(guān)［7-8］。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶31(serine/threonine kinases 31，STK31)基因是一種癌-睪丸基因，存在于人類多種腫瘤組織，而在正常情況下，僅存在于精細(xì)胞及睪丸［9-10］。Kuo等［11］研究發(fā)現(xiàn)，STK31可能與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)，并且STK31表達(dá)可增加細(xì)胞遷移能力與侵襲能力。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在結(jié)腸癌中，STK31基因的表達(dá)受到其啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的調(diào)控，STK31基因有助于保持結(jié)腸癌細(xì)胞的未分化狀態(tài)，并且敲除STK31基因后，通過加強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞的分化程度，抑制體內(nèi)外腫瘤的發(fā)生［12］。目前有關(guān)STK31啟動子及第1外顯子區(qū)甲基化及表達(dá)與HPV感染的關(guān)系在宮頸癌中的研究鮮見報(bào)道。

本研究采用亞硫酸氫鹽基因組測序法(bisulfite genomic sequencing，BGS)及甲基化特異性PCR (methylation-specific PCR, MSP)檢測宮頸癌細(xì)胞系中STK31基因啟動子及第1外顯子甲基化狀態(tài)，RT-PCR及蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測STK31基因及不同種類甲基轉(zhuǎn)移酶(DNAmethyltransferases，DNMTs) DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b、DNMT3L等基因在宮頸癌細(xì)胞系及相關(guān)宮頸癌組織中的表達(dá)，旨在探討HPV感染與STK31基因啟動子及第1外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)的關(guān)系以及不同種類DNMTs基因在STK31基因甲基化狀態(tài)改變中的潛在作用；明確該基因表達(dá)是否受其啟動子甲基化狀態(tài)的調(diào)控；探究STK31基因在宮頸癌中的潛在作用，為HPV相關(guān)宮頸癌的診斷、治療提供表觀遺傳學(xué)分子機(jī)制的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)

外源性HPV16E6、E7及E6/E7基因共表達(dá)慢病毒由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其克隆載體為LV5，克隆位點(diǎn)是NotⅠ/ BamHⅠ，合成的病毒滴度分別如下：E6為2×108TU/mL，E7為2×108TU/mL ，E6/E7為1×108TU/mL，慢病毒空載體為1×108TU/mL。將整合有外源性HPV16E6、E7及E6/E7基因的慢病毒及慢病毒空載體感染兩種HPV陰性宮頸癌細(xì)胞系HT-3及C33A細(xì)胞，溫育72 h后進(jìn)行檢測。用嘌呤霉素篩選感染后的細(xì)胞，建立穩(wěn)定感染的細(xì)胞系，分別記為HT-3空載、HT-3E6、HT-3E7和HT-3E6/E7、C33A空載、C33AE6、C33AE7和C33AE6/E7。采用Western blot驗(yàn)證外源性HPV16E6、E7及E6/E7基因在轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中的表達(dá)。宮頸癌細(xì)胞系均用含有10%胎牛血清(購自美國Gibco公司)、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基(購自美國Gibco公司)，在37 ℃、飽和濕度、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

1.2 細(xì)胞DNA提取及 DNA亞硫酸鹽修飾

采用飽和酚－氯仿抽提法提取宮頸癌細(xì)胞系DNA，1.5%瓊脂糖電泳檢查提取的基因組DNA的完整性，所有基因組DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測波長260 nm處吸光度(D)值與波長280 nm處D值比值均在1.9～2.1。將所提取的基因組DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾，采用德國QIAGEN公司的快速DNA亞硫酸鹽修飾處理劑盒。操作嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行。

1.3 BGS及MSP檢測

BGS及MSP引物采用Methy primer express v1.0軟件設(shè)計(jì)，具體序列及反應(yīng)條件見表1。BGS方法檢測宮頸癌細(xì)胞系HeLa、SiHa、CasKi、HT-3、C33A、HT-3空載、HT-3E6、HT-3E7、HT-3E6/E7、C33A空載、C33AE6、C33AE7和C33AE6/E7中STK31基因啟動子及第1外顯子區(qū)的甲基化狀態(tài)，其反應(yīng)體系：TaqHS (5 U/μL) 0.3 μL、10×PCR緩沖液(含Mg2+) 3 μL、dNTPs (2.5 mmol/L) 3 μL、上游及下游引物各(10 μmol) 1.8 μL、0.05 μg亞硫酸鹽修飾后細(xì)胞DNA作為模板、去離子水加至30 μL。PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳，鑒定擴(kuò)增結(jié)果。PCR產(chǎn)物送上海邁浦生物科技有限公司進(jìn)行TA克隆測序。MSP檢測方法用來驗(yàn)證上述13種宮頸癌細(xì)胞系中STK31基因的甲基化狀態(tài)，采用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR擴(kuò)增結(jié)果。引物序列及產(chǎn)物大小見表1。

1.4 RNA提取及熒光定量PCR檢測

TRIzol一步法提取宮頸癌細(xì)胞系及宮頸癌組織總RNA，采用瑞士Roche公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測STK31基因及DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b、DNMT3L基因在宮頸癌細(xì)胞系及宮頸癌組織中mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，同時(shí)以管家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作為內(nèi)參照，每一個(gè)樣本均設(shè)3個(gè)重復(fù)。20 μL反應(yīng)體系含Mix：10 μL、上下游引物各1 μL、PCR水8 μL、cDNA 1 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共40個(gè)循環(huán)。引物序列及產(chǎn)物大小見表1。

1.5 Western blot檢測

常規(guī)方法提取宮頸癌細(xì)胞系總蛋白，行SDS-PAGE。HPV16 E6/E7蛋白PVDF轉(zhuǎn)膜10 V，15 min；STK31蛋白檢測轉(zhuǎn)膜10 V，30 min。用TBST配置5%脫脂奶粉封閉2 h。一抗為HPV16 E6、E7單克隆抗體(1∶1 000)以及STK31單克隆抗體(1∶1 000)，二抗為辣根過氧化物標(biāo)記的山羊抗兔抗體(1∶5 000)，加DAB顯色后分析目的蛋白表達(dá)情況。本實(shí)驗(yàn)中一抗購自美國Abcam公司，二抗及DAB顯色液購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

表 1 BGS、MSP及RT-PCR所用引物序列及反應(yīng)條件Tab. 1 The primer sequences and reaction conditions of BGS, MSP and RT-PCR

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用t檢驗(yàn)比較轉(zhuǎn)染后細(xì)胞系HT-3E7與HT-3E6/E7之間、C33AE67與C33AE6/E7之間的STK31 mRNA表達(dá)的差異，并比較HPV16E6、E7轉(zhuǎn)染前后宮頸癌細(xì)胞系及HPV陰、陽性宮頸癌之間的DNMTs轉(zhuǎn)錄水平。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 外源性HPV16 E6、E7及E6/E7蛋白在HPV陰性宮頸癌細(xì)胞系HT-3及C33A中穩(wěn)定表達(dá)

Western blot檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞系穩(wěn)定表達(dá)HPV16 E6、E7及E6/E7蛋白，轉(zhuǎn)染效率較高(圖1)。

圖 1 Western blot檢測HPV16 E6、E7及E6/E7轉(zhuǎn)染效率Fig. 1 The transfection efficiencies of HPV16 E6, E7 and E6/E7 were tested by Western blot

2.2 宮頸癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)染前后及HPV陰、陽性宮頸癌組織中STK31基因的甲基化狀態(tài)的差異

BGS擴(kuò)增PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后可觀察到499 bp的特異性目的片段。電泳結(jié)果見圖2。TA克隆后，分別選取13種宮頸癌細(xì)胞系各6個(gè)陽性克隆進(jìn)行測序，檢測STK31基因啟動子及第1外顯子區(qū)CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。結(jié)果表明，其甲基化率在3種HPV陽性細(xì)胞系HeLa(46.4%)、SiHa(50.0%)和CasKi(49.1%)中低于2種HPV陰性宮頸癌細(xì)胞系HT-3(98.2%)和C33A(95.5%)；HT-3空載及C33A空載分別與HT-3、C33A細(xì)胞系比較，STK31啟動子及第1外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)未見明顯改變；HPV16 E6、E7及E6/E7異位表達(dá)細(xì)胞系中，HT-3E7、HT-3E6/E7、C33AE7和C33AE6/E7細(xì)胞系中STK31基因甲基化水平較轉(zhuǎn)染前細(xì)胞系明顯下降，而轉(zhuǎn)染后細(xì)胞系HT-3E6、C33AE6中STK31基因甲基化狀態(tài)較轉(zhuǎn)染前細(xì)胞系則未見明顯改變。具體結(jié)果見圖3。圖4為截取的HPV陰性宮頸癌細(xì)胞系C33A部分序列測序信號結(jié)果，未見套峰及雜峰現(xiàn)象，測序結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

宮頸癌細(xì)胞系中STK31基因啟動子及第1外顯子MSP檢測結(jié)果與BGS一致，在HPV陽性宮頸癌細(xì)胞系HeLa、SiHa、Caski及轉(zhuǎn)染后細(xì)胞系HT-3E6/E7、C33AE6/E7中只出現(xiàn)U條帶；在2種HPV陰性細(xì)胞系HT-3、C-33A，及HT-3空載、HT-3E6、C33A空載和C33AE6細(xì)胞系中只檢測到M條帶；在轉(zhuǎn)染后細(xì)胞系HT-3E7、C33AE7中出現(xiàn)M+U條帶。MSP檢測54例HPV16陽性宮頸癌組織及17例HPV陰性宮頸癌組織中STK31基因啟動子及第1外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)。結(jié)果顯示，其在HPV16陽性宮頸癌組織中的甲基化率(15/54)明顯低于HPV陰性宮頸癌組織(10/17)。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.463，P=0.019，表2，圖5)。

2.3 宮頸癌細(xì)胞系中HPV感染通過調(diào)節(jié)STK31基因啟動子及第1外顯子甲基化狀態(tài)影響其基因的表達(dá)

RT-PCR電泳結(jié)果見圖6A，Western blot檢測結(jié)果見圖6B。在3種HPV陽性宮頸癌細(xì)胞系HeLa、SiHa和CasKi中可檢測到STK31基因的表達(dá)、STK31基因在2種HPV陰性宮頸癌細(xì)胞系HT-3和C-33A中表達(dá)缺失；整合有HPV16 E6、E7及E6/E7癌基因的慢病毒轉(zhuǎn)染HPV陰性細(xì)胞系HT-3和C33A后，STK31基因在轉(zhuǎn)染后細(xì)胞系HT-3E7、HT-3E6/E7、C33AE7和C33AE6/ E7中重新表達(dá)，而在轉(zhuǎn)染后細(xì)胞系HT-3E6和C33AE6中未檢測到STK31基因表達(dá)；STK31基因在HT-3E6/E7和C33AE6/E7細(xì)胞系中轉(zhuǎn)錄水平分別高于HT-3E7和C33AE7。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.422，P=0.036；t=7.158，P＜0.001，圖7)。

2.4DNMT、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b和DNMT3L基因mRNA在外源性HPV16E6/E7轉(zhuǎn)染前后宮頸癌細(xì)胞系及HPV陰陽性宮頸癌標(biāo)本中表達(dá)水平的比較

熒光定量PCR法檢測結(jié)果顯示，DNMT1、DNMT3a、DNMT3b在HT-3E6/E7和C33AE6/ E7細(xì)胞系中mRNA水平分別高于HT-3空載和C33A空載細(xì)胞系。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.134，P＜0.001；t=6.134，P＜0.001；t=8.971，P＜0.001；t=6.543，P＜0.001；t=5.164，P＜0.001；t=8.997，P＜0.001)；DNMT1、DNMT3a和DNMT3b基因的mRNA水平在HPV16陽性宮頸癌組織中的表達(dá)高于HPV陰性宮頸癌組織(t=5.997，P＜0.001；t=6.743，P＜0.001；t=7.926，P＜0.001)。DNMT2基因在HT-3E6/ E7和C33AE6/E7細(xì)胞系中mRNA表達(dá)水平分別低于HT-3空載C33A空載。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.451，P＜0.001；t=2.451，P＜0.05)；DNMT2轉(zhuǎn)錄水平在HPV16陽性宮頸癌組織中低于HPV陰性宮頸癌組織(t=9.134，P＜0.001)。DNMT3L mRNA表達(dá)水平在宮頸癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)染前后及HPV陰陽性宮頸癌組織中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖8)。

圖 2 BGS檢測13種宮頸癌細(xì)胞系中STK31基因甲基化電泳結(jié)果Fig. 2 BGS results of STK31 gene promoter/exon1 methylation status in cervical cancer cell lines

圖 3 宮頸癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)染前后STK31基因啟動子及第1外顯子區(qū)TA克隆測序結(jié)果Fig. 3 CpG methylation status of STK31 gene promoter/exon1 in cervical cancer cell lines before and after transfection with lentivirus vectors detected by TA clone.

圖 4 HPV陰性細(xì)胞系C33A中STK31基因啟動子區(qū)部分位點(diǎn)甲基化狀態(tài)測序結(jié)果Fig. 4 Sequencing results of STK31 gene promoter/exon1 in C33A cells

表 2 宮頸癌組織標(biāo)本中STK31基因甲基化狀態(tài)與HPV感染之間的關(guān)系Tab. 2 Correlations between STK31 methylation and HPV infection in human cervical cancers

圖 5 MSP檢測13種宮頸癌細(xì)胞系中STK31基因啟動子及第1外顯子區(qū)甲基化電泳結(jié)果Fig. 5 MSP results of STK31 gene promoter/exon1 in 13 cervical cancer cell lines

圖 6 RT-PCR和Western blot檢測13種宮頸癌細(xì)胞系中STK31基因轉(zhuǎn)錄和翻譯Fig. 6 mRNA and protein expression of STK31 gene in 13 cervical cancer cell lines detected by RT-PCR and Western blot

圖 7 熒光定量PCR方法比較不同細(xì)胞系中STK31基因表達(dá)差異Fig. 7 Real-time fluorescent quantitative PCR (qPCR) was used to compare STK31 gene expression in different cell lines

圖 8 qPCR檢測DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b和DNMT3L基因的mRNA在外源性HPV16 E6/E7轉(zhuǎn)染前后宮頸癌細(xì)胞系及HPV陰陽性宮頸癌標(biāo)本中表達(dá)水平Fig. 8 mRNA expression of DNMT1, DNMT2, DNMT3a, DNMT3b and DNMT3L genes in cervical cancer cell lines before and after HPV16 E6/E7-lentivirus transfection, and in HPV16-positive and HPV-negative cervical cancer samples

3 討 論

高危型HPV感染是宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的重要條件，雖然HPV感染在女性中十分常見，只有很小比例的HPV感染者發(fā)展為侵襲性宮頸癌。因此，宮頸涂片檢測出HPV陽性的診斷及預(yù)后價(jià)值就有所減小。研究表明，HPV中兩種致癌蛋白E6、E7可通過不同的途徑，在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用［4,13-14］。HPV感染與某些抑癌基因或癌基因的異常甲基化密切相關(guān)，因此，探索一組新的、腫瘤特異性的、具有更高敏感性及特異性的生物學(xué)標(biāo)志，如甲基化相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志，則有助于早期發(fā)現(xiàn)宮頸癌，提高沒有條件定期做宮頸涂片篩查者的安全性，預(yù)測高危型HPV感染者的預(yù)后，指導(dǎo)HPV相關(guān)性腫瘤的治療［15-16］。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，HPV陽性宮頸癌細(xì)胞系中STK31基因甲基化水平低于HPV陰性宮頸癌細(xì)胞系，HPV16E7及E6/E7異位表達(dá)的HPV陰性細(xì)胞系中STK31基因甲基化程度降低，且STK31基因甲基化程度在HPV16陽性宮頸癌組織中低于HPV陰性宮頸癌組織，表明HPV感染可能影響STK31基因啟動子及第1外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)。由此推測，通過聯(lián)合檢測STK31基因的甲基化狀態(tài)，可以提高HPV檢測的特異性，為進(jìn)一步HPV相關(guān)性腫瘤的診斷、預(yù)后及治療等提供理論依據(jù)。

STK31基因表達(dá)受到其啟動子及第1外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)的調(diào)控，高甲基化水平抑制該基因表達(dá)。雖然轉(zhuǎn)染后細(xì)胞系HT-3E6和C33AE6中STK31基因甲基化狀態(tài)及其表達(dá)情況分別較轉(zhuǎn)染前無明顯改變，HT-3E6/E7和C33AE6/E7的表達(dá)分別高于HT-3E7和C33AE7細(xì)胞系，提示HPV16 E6可能對STK31的表達(dá)同樣起一定的調(diào)控作用。

DNA甲基化過程是在DNMTs的催化作用下發(fā)生的。目前已研究報(bào)道的DNMTs主要有3 種，包括DNMT1、DNMT2和DNMT3，不同種類的DNMTs在DNA甲基化過程中起不同的作用。DNMT1在細(xì)胞分裂中起重要的、維持基因甲基化狀態(tài)的作用，與一些腫瘤抑制基因的甲基化有關(guān)，在腫瘤的診斷與治療中具有重要的潛在性作用［17-19］。DNMT2具有微弱的DNMT活性，其主要具有天門冬氨酸t(yī)RNA的甲基轉(zhuǎn)移酶活性［20］，雖然DNMT2在原生生物、植物、真菌和動物中具有高度同源性，是最保守的DNMT蛋白，令人感興趣的是，DNMT2的功能至今研究報(bào)道較少［21］。DNMT3主要分為3類，即DNMT3a、DNMT3b和DNMT3L。DNMT3a與DNMT3b具有相似的結(jié)構(gòu)，參與DNA從頭甲基化，DNMT3L單獨(dú)沒有催化能力，但可以與DNMT3a、DNMT3b相互作用調(diào)節(jié)其活性。

本研究結(jié)果表明，DNMT1、DNMT3a和DNMT3b基因轉(zhuǎn)錄水平在異位性表達(dá)HPV16 E6/ E7的慢病毒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞系高于無編碼HPV16 E6/ E7的慢病毒空載體轉(zhuǎn)染后細(xì)胞系，且DNMT1、DNMT3a和DNMT3b基因的mRNA表達(dá)在HPV16陽性宮頸癌組織高于HPV陰性宮頸癌組織；而STK31基因啟動子及第1外顯子區(qū)甲基化率在異位性表達(dá)HPV16 E6/E7的慢病毒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞系低于慢病毒空載體轉(zhuǎn)染后宮頸癌細(xì)胞系，STK31基因啟動子及第1外顯子區(qū)甲基化率在HPV陽性宮頸癌組織中低于HPV陰性宮頸癌組織，表明DNMT1、DNMT3a和DNMT3b可能不參與癌基因STK31基因啟動子及第1外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)的調(diào)控。研究報(bào)道表明，DNMT1主要參與一些抑癌基因的甲基化，且DNMT1高表達(dá)總是會伴有基因組和癌基因的低甲基化，或抑癌基因的高甲基化［20，22］；STK31基因是一種癌基因，其甲基化率在DNMT1相對高表達(dá)的HPV16陽性的宮頸癌細(xì)胞系及宮頸癌組織中低于在DNMT1相對低表達(dá)的HPV陰性宮頸癌細(xì)胞系及宮頸癌組織。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述研究報(bào)道結(jié)果相符。DNMT2 mRNA水平在異位性HPV16E6/E7表達(dá)的細(xì)胞系中低于HPV陰性宮頸癌細(xì)胞系，且DNMT2甲基轉(zhuǎn)錄水平在HPV16陽性宮頸癌組織中低于HPV陰性宮頸癌組織，STK31基因甲基化水平在HPV16E6/E7轉(zhuǎn)染后細(xì)胞系及HPV16陽性宮頸癌組織中分別低于慢病毒空載體宮頸癌細(xì)胞系及宮頸癌組織，表明STK31基因啟動子及第1外顯子區(qū)甲基化轉(zhuǎn)移酶可能是DNMT2分子，HPV16 E6、E7可能通過影響DNMT2的表達(dá)參與調(diào)控癌基因STK31基因啟動子及第1外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)；DNMT2具有微弱的DNMT活性，其表達(dá)差異與STK31基因啟動子及第1外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)相關(guān)。本研究推測，DNMT2可能參與某些癌基因甲基化狀態(tài)的調(diào)控。

研究證實(shí)，STK31基因的表達(dá)受到其啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的調(diào)控，可通過抑制細(xì)胞凋亡，保持細(xì)胞的未分化狀態(tài)等機(jī)制在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用［11-12］。STK31是一種癌-睪丸基因，存在于多種腫瘤中，在正常組織僅存在于睪丸及精細(xì)胞。睪丸是一個(gè)免疫豁免器官，用特異性的T細(xì)胞靶向性的識別癌-睪丸抗原不會引起其他不良反應(yīng)。因此，癌-睪丸抗原可能在人類腫瘤中是一個(gè)潛在的診斷性、治療性、預(yù)后性的生物學(xué)標(biāo)志［23］。我們推測，開展STK31抗原在宮頸癌中免疫學(xué)特性的研究，可以為STK31基因在宮頸癌免疫學(xué)治療中的潛在作用提供線索與理論依據(jù)。

本研究初步證實(shí)了HPV感染，尤其是HPVE6、E7及E6/E7可能通過調(diào)控STK31基因啟動子及第1外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)來影響宮頸癌中STK31基因表達(dá)，清除HPV感染可能通過減弱對其靶基因STK31的表達(dá)促進(jìn)作用，發(fā)揮腫瘤抑制作用；HPVE6、E7及E6/E7可能通過影響DNMT2的表達(dá)來調(diào)控STK31基因啟動子及第1外顯子區(qū)甲基化狀態(tài)，當(dāng)然還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)，如Western blot等；但仍有許多問題需要進(jìn)一步深入研究，如STK31基因啟動子及第1外顯子異常甲基化與宮頸癌侵襲性及轉(zhuǎn)移性的關(guān)系及相關(guān)具體機(jī)制，STK31抗原在宮頸癌中的免疫學(xué)特征等。總之，STK31基因異常甲基化可能是HPV感染相關(guān)宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的一個(gè)新的甲基化相關(guān)的分子生物學(xué)標(biāo)志物，并有望用于腫瘤的早期診斷、預(yù)后分析和治療指導(dǎo)。因而對STK31基因的進(jìn)一步深入研究，有助于為宮頸癌的診斷和治療提供新的思路及理論依據(jù)。

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“惠爾血支持按時(shí)足劑量化療”2015年度有獎?wù)魑耐ㄖ?/p>

眾所周知，按時(shí)足劑量化療對于改善癌癥（乳腺癌、淋巴瘤、卵巢癌、結(jié)直腸癌及非小細(xì)胞肺癌等）患者的預(yù)后具有重要意義。然而，大多數(shù)的化療方案存在一定的血液毒性，極大程度地降低了患者完成按時(shí)足劑量、足療程化療的比例?；轄栄ㄖ亟M人粒細(xì)胞刺激因子）從20世紀(jì)90年代面世至今，造福了數(shù)以百萬計(jì)的癌癥化療患者。

為進(jìn)一步探索并評估惠爾血支持按時(shí)、足劑量、足療程化療的臨床效果，促進(jìn)臨床經(jīng)驗(yàn)交流，《中國癌癥雜志》特舉辦“惠爾血支持癌癥患者按時(shí)足劑量化療有獎?wù)魑摹被顒?，現(xiàn)將征文活動事項(xiàng)通知如下：

征文內(nèi)容：

⑴ 惠爾血應(yīng)用于癌癥患者，支持癌癥患者完成按時(shí)足劑量化療的多病例、分組研究等臨床研究，其中患者類型及化療方案不限。

⑵ 惠爾血支持按時(shí)足劑量化療的個(gè)案報(bào)道（個(gè)案報(bào)道要求特異性與新穎性）。

⑶ 惠爾血在不同的化療方案中的作用等。

征文要求及提交：

⑴ 為首次投稿，未公開發(fā)表過。

⑵ 征文格式參照《中國癌癥雜志》稿約要求，撰寫論文。

⑶ 請將論文電子文檔，通過郵件發(fā)送至：kirin2015zwhd@163.com（注明“征文活動”）。

⑷ 請注明作者、單位、地址、職稱、郵編和聯(lián)系電話等信息。

征文截止日期：

截止日期為2015年12月31日（以E-mail發(fā)出時(shí)間為準(zhǔn)）。

評選方法：

⑴ 由《中國癌癥雜志》編輯部組織專家成立評審委員會，以公正、公平的方式評選，在征文截稿后評選2015年度獲獎?wù)撐?。設(shè)立一等獎2名，二等獎5名，三等獎15名，并頒發(fā)獲獎證書。

⑵ 獲獎?wù)撐慕?jīng)《中國癌癥雜志》審稿通過后可優(yōu)先在《中國癌癥雜志》上發(fā)表。

⑶ 一等獎獲得者可獲資助參加歐美學(xué)術(shù)會議一次；二等獎獲得者可獲資助參加亞太學(xué)術(shù)會議一次；三等獎獲得者可獲資助參加國內(nèi)學(xué)術(shù)會議一次。

⑷ 全部論文將以《中國癌癥雜志》編輯部名義頒發(fā)證書，并編入《論文匯編》。

《中國癌癥雜志》編輯部

協(xié)和發(fā)酵麒麟（中國）制藥有限公司

The roles of HPV16 E6, E7 and E6/E7 genes in STK31 promoter/exon1 methylation and expression levels in cervical cancer cell lines

YIN Fufen, WANG Ning, YU Xiao, BI Xiaoning, XU Xiaohui, WANG Yankui

(Department of Obstetrics and Gynecology, Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong, China)
Correspondence to: WANG Yankui E-mail: qdwykpro@163.com

Serine/threonine kinases 31 gene; Methylation; HPV16; Cervical cancer; Biomarker

10.3969/j.issn.1007-3969.2015.09.001

R737.33

A

1007-3639(2015)09-0641-11

2015-04-18

2015-08-10）

國家自然科學(xué)基金(81172480)。

王言奎 E-mail:qdwykpro@163.com