尹應(yīng)樂(lè)， 李 靜， 陳新泰， 陸 杰， 劉最芳， 陳緒煌*,

(1.湖北工業(yè)大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，湖北武漢 430068； 2.湖北工業(yè)大學(xué)綠色輕工材料湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430068； 3.空軍預(yù)警學(xué)院黃陂士官學(xué)校，湖北武漢 432200)

二茂鐵是20世紀(jì)50年代發(fā)現(xiàn)的一種結(jié)構(gòu)性質(zhì)特殊、具有重要理論價(jià)值和廣闊應(yīng)用前景的茂金屬化合物的典型代表。二茂鐵衍生物是一類(lèi)富電子體系物質(zhì)，此類(lèi)物質(zhì)修飾電極的特征是膜中含有氧化還原中心，在電位掃描過(guò)程中能發(fā)生氧化或還原反應(yīng)，還能對(duì)反應(yīng)物活化或促進(jìn)電子的轉(zhuǎn)移速率[1]。小分子電介體易流失增加了電極的不穩(wěn)定性，限制了其在臨床醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用，而聚合物電介體的出現(xiàn)解決了小分子電介體易流失的缺點(diǎn)，成為近年來(lái)研究熱點(diǎn)，其中以乙烯基二茂鐵(VFc)的研究最為廣泛。從VFc的分子結(jié)構(gòu)上來(lái)看，VFc為單取代烯類(lèi)單體可與其他帶功能性基團(tuán)的乙烯基單體共聚合成聚合物電介體[2 - 6]，與小分子電介體相比擴(kuò)散系數(shù)較低，從而減少電介體流失對(duì)電極穩(wěn)定性的影響及其應(yīng)用的限制；另一方面VFc含有氧化還原中心即二茂鐵基團(tuán)，因而聚合物電介體可以通過(guò)“電子跳槽”來(lái)進(jìn)行電子轉(zhuǎn)移，即電子沿著固定在高分子鏈上的氧化還原中心(二茂鐵基團(tuán))，經(jīng)過(guò)一系列從還原態(tài)的二茂鐵基團(tuán)向氧化態(tài)的二茂鐵基團(tuán)跳槽來(lái)完成電子的不斷傳遞[7，8]，且VFc的氧化還原電位較低，僅為0.4 V左右[9]。

1 乙烯基二茂鐵自由基聚合的特點(diǎn)

VFc的分子結(jié)構(gòu)與苯乙烯有些類(lèi)似，但VFc苯溶液中自由基聚合并不遵循常規(guī)乙烯基單體自由基聚合機(jī)理。George[10，11]通過(guò)研究由偶氮二異丁腈(AIBN)引發(fā)VFc在苯溶液中均聚聚合機(jī)理證實(shí)了VFc聚合的特異性，其原因是存在“分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移”，即以VFc基團(tuán)為端基的增長(zhǎng)鏈自由基容易發(fā)生電子由二茂鐵基團(tuán)向自由基轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致鏈自由基失活和增長(zhǎng)鏈的提前終止，同時(shí)該反應(yīng)的發(fā)生將產(chǎn)生順磁性Fe(Ⅲ)。乙烯基單體自由基聚合的電子轉(zhuǎn)移終止現(xiàn)象已經(jīng)被一些學(xué)者所證實(shí)[12，13]，但不同點(diǎn)是該電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的發(fā)生需要添加金屬鹵化物，并且此反應(yīng)屬于分子間電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)，因此“分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移”可用來(lái)描述VFc這種新型的終止方式。Tinker等[14]通過(guò)研究VFc在1,4-二惡烷中的聚合過(guò)程，發(fā)現(xiàn)其聚合速率分別與單體濃度的0.97次方和引發(fā)劑濃度的0.42次方成正比，基本上與常規(guī)乙烯基單體聚合速率關(guān)系式相吻合，即該聚合過(guò)程遵循常規(guī)乙烯基單體的聚合機(jī)理，并通過(guò)穆斯堡爾譜證實(shí)了均聚物中并不存在Fe(Ⅲ)，說(shuō)明反應(yīng)過(guò)程中不存在“分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移”。Tinker提出造成VFc在苯和1,4-二惡烷中聚合的顯著性差別可能與苯參與“分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移”有關(guān)，一些學(xué)者也證實(shí)了苯可與VFc之間發(fā)生特殊反應(yīng)[15，16]，而1,4-二惡烷有效避免了該反應(yīng)的發(fā)生，可能與1,4-二惡烷分子中不含共軛π鍵較為穩(wěn)定有關(guān)。George等[17]通過(guò)電子自旋共振波譜發(fā)現(xiàn)VFc與丁二烯在1,4-二惡烷中聚合的共聚物中含有Fe(Ⅲ)，說(shuō)明該聚合過(guò)程存在“分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移”，即該聚合過(guò)程并不遵循常規(guī)乙烯基單體聚合機(jī)理，提出了VFc在1,4-二惡烷溶液中均聚與共聚機(jī)理之間的差異可能與溶劑效應(yīng)和位阻效應(yīng)有關(guān)。隨著對(duì)VFc聚合的進(jìn)一步研究，水[18]、1,4-二惡烷與乙醇的混合溶液[19]、乙醇與水的混合溶液[20]也逐漸地作為VFc聚合的溶劑。

2 修飾電極的制備及表征

2.1 修飾電極的制備

分子自組裝技術(shù)可有效縮短酶活性中心和電極表面間的距離，但對(duì)酶的空間取向要求較高，且固定在電極上的酶和聚合物電介體的量有限，底物在電極表面的反應(yīng)速度緩慢[21]。Hiller等[22]試圖將聚合物電介體和葡萄糖氧化酶共同物理吸附于碳電極上，這種方法要求聚合物電介體必須有很長(zhǎng)的分子鏈，既提供足夠的吸附鏈段以防止脫附，又要確保其具有足夠的柔性鏈段，使其能夠穿透酶蛋白而抵達(dá)酶的活性中心，進(jìn)而進(jìn)行電子傳遞，然而同時(shí)滿足這兩方面十分困難。為防止柔性鏈聚合物電介體流失，通常需要在電極上采用包埋的方法，如使用半透析膜[23]、導(dǎo)電聚合物膜[24]、碳糊[25]等。溶膠-凝膠制備工藝簡(jiǎn)單，其多空結(jié)構(gòu)適合固定生物大分子，且物理化學(xué)性質(zhì)如孔徑、粘度、成型形狀、化學(xué)組成、比表面積、導(dǎo)電性等易于控制，加之其優(yōu)異的光學(xué)透過(guò)性能為生物傳感器的制備提供更多機(jī)會(huì)和條件[26]?；碌狭恋萚27]采用納米金溶膠與二茂鐵構(gòu)成復(fù)合固酶基質(zhì)，以溶膠-凝膠法固定葡萄糖氧化酶于金溶膠和二茂鐵混合制備的碳糊電極表面，增強(qiáng)了葡萄糖氧化酶活性中心與電介體之間的電子轉(zhuǎn)移速率，使傳感器的線性范圍、壽命和靈敏度顯著提高。

2.2 修飾電極的表征

對(duì)電活性物質(zhì)的研究，循環(huán)伏安法是一種常用的多功能電化學(xué)分析方法，適合于氧化還原反應(yīng)的表征和機(jī)理研究，在電化學(xué)生物傳感器領(lǐng)域應(yīng)用較為廣泛[28 - 31]。循環(huán)伏安法是在固定面積的工作電極和參比電極之間加上對(duì)稱(chēng)的三角波掃描電位，記錄工作電極上得到的電流與施加電位的關(guān)系曲線，即循環(huán)伏安圖。Senel等[32]采用VFc與甲基丙烯酸縮水甘油酯的共聚物薄膜將過(guò)氧化氫酶固定于玻碳電極上來(lái)制備一種新型的過(guò)氧化氫生物傳感器，并通過(guò)循環(huán)伏安法來(lái)進(jìn)行酶電極電化學(xué)性能的表征。研究發(fā)現(xiàn)存在過(guò)氧化氫時(shí)，酶電極氧化峰電流明顯高于不存在過(guò)氧化氫時(shí)的電流，表明催化反應(yīng)提高了酶電極的氧化電流和辣根過(guò)氧化物酶催化過(guò)氧化氫發(fā)生氧化是以共聚物電介體中的二茂鐵基團(tuán)作為媒介的，即該含乙烯基二茂鐵結(jié)構(gòu)單元共聚物電介體可有效地將酶活性中心的電子轉(zhuǎn)移至電極的表面。

3 修飾電極電化學(xué)性能的影響因素

3.1 測(cè)試電位的影響

含VFc結(jié)構(gòu)單元的聚合物電介體中含有氧化還原中心，在電位掃描的過(guò)程中可發(fā)生氧化還原反應(yīng)。Himuro等[9]通過(guò)不同測(cè)試電位下酶電極循環(huán)伏安圖的差異來(lái)研究測(cè)試電位的影響。研究表明電流密度隨著葡萄糖濃度的增加而增加，并隨檢測(cè)電位的升高催化電流密度增長(zhǎng)速率隨之增加，即在高的檢測(cè)電位下有利于聚合物電介體中的二茂鐵基團(tuán)發(fā)生氧化還原反應(yīng)，從而提高了電極表面與葡萄糖氧化酶活性中心之間電子轉(zhuǎn)移的速率。但盡管如此，過(guò)高的檢測(cè)電位會(huì)使一些電活性物質(zhì)比如尿酸、抗壞血酸等氧化產(chǎn)生電流，這將對(duì)葡萄糖檢測(cè)產(chǎn)生干擾，因此選擇合適的檢測(cè)電位可以提高電化學(xué)分析檢測(cè)的精度。Saito[25]指出當(dāng)檢測(cè)電位略高于聚合物電介體的氧化還原電位，酶電極即可電化學(xué)催化葡萄糖氧化。

3.2 膜厚度的影響

Himuro等[9]通過(guò)調(diào)整修飾電極氧化還原聚合物溶液的量來(lái)改變聚合物電介體薄膜的厚度，進(jìn)而研究其對(duì)電極電化學(xué)性能的影響。研究表明隨著氧化還原聚合物薄膜的厚度的增加，氧化和還原峰電流密度都隨著增加。其原因?yàn)殡S著氧化還原聚合物薄膜厚度的增加，其中所含的氧化態(tài)的二茂鐵基團(tuán)的數(shù)量也隨之增加，這有利于電子快速地由酶的活性中心轉(zhuǎn)移至電極的表面，從而表現(xiàn)出電流密度的增加。

3.3 測(cè)試溫度的影響

溫度對(duì)酶電極電化學(xué)性能的影響主要表現(xiàn)為酶活性的高低與所處的溫度有關(guān)。Cevik等[32]通過(guò)檢測(cè)溫度30～50 ℃范圍內(nèi)酶電極的催化電流密度，發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高催化電流也隨之升高并在45 ℃下達(dá)到最大值，隨后逐漸下降，其原因在于辣根過(guò)氧化物酶在適宜的溫度范圍內(nèi)表現(xiàn)出較高的活性，有利于催化過(guò)氧化氫的氧化。Cevik同時(shí)還指出在最初的溫度區(qū)域內(nèi)催化電流與溫度的關(guān)系符合阿倫尼斯模型，計(jì)算出的活化能Ea為1.67 kJ/mol小于Zhang[33]用聚苯胺固定辣根過(guò)氧化物酶案例中的酶活化能，表明辣根過(guò)氧化物酶固定在甲基丙烯酸縮水甘油酯與VFc共聚物薄膜上表現(xiàn)出較高的活性。

3.4 乙烯基二茂鐵結(jié)構(gòu)單元含量的影響

Saito等[25]制備了不同VFc結(jié)構(gòu)單元含量的VFc與甲基丙烯酸羥基乙酯(HEMA)共聚物，并研究了其對(duì)酶電極電化學(xué)性能的影響。實(shí)驗(yàn)表明隨著聚合物電介體中VFc結(jié)構(gòu)單元增加，催化電流密度也隨之增加并出現(xiàn)極大值，隨后逐漸降低。VFc-HEMA共聚物為兩性聚合物，包含有疏水性VFc結(jié)構(gòu)單元和親水性HEMA結(jié)構(gòu)單元。在低含量VFc結(jié)構(gòu)單元情況下，隨著VFc結(jié)構(gòu)單元含量的增加，酶活性中心附近氧化態(tài)的二茂鐵基團(tuán)的量也隨之增加，從而有利于電子在酶活性中心與電極表面之間的轉(zhuǎn)移，表現(xiàn)出電流密度隨之增加，然而隨著VFc結(jié)構(gòu)單元的增加，共聚物逐漸由親水性轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷?，伴隨著葡萄糖分子向酶電極擴(kuò)散的能力隨之下降，進(jìn)而減少了被葡萄糖氧化酶氧化的葡萄糖的數(shù)量，與此同時(shí)，聚合物鏈中VFc結(jié)構(gòu)單元含量越高，其鏈的柔性也就越低，也就降低了其穿透酶蛋白而抵達(dá)酶活性中心的能力，因而高VFc結(jié)構(gòu)單元含量的共聚物表現(xiàn)出催化電流密度降低。同時(shí)，Saito[34]另一篇論文的觀點(diǎn)與該結(jié)論相符。

3.5 聚合物電介體中殘留單體的影響

聚合物電介體中殘留共聚單體將會(huì)影響酶電極的穩(wěn)定性。VFc與其他乙烯基單體(如丙烯酰胺)相比，自由基聚合單體競(jìng)聚率較小，隨著聚合反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)液中殘余的丙烯酰胺與VFc之間的比值將逐漸減小，即反應(yīng)后期反應(yīng)液中殘余的VFc單體含量相對(duì)較高，如果反應(yīng)不充分，反應(yīng)液中易殘留一部分未反應(yīng)VFc單體。小分子擴(kuò)散系數(shù)相對(duì)較大，用未純化的聚合物電介體修飾電極會(huì)造成小分子電介體向檢測(cè)液擴(kuò)散。隨著聚合物電介體中殘余單體的流失，承擔(dān)酶活性中心與電極表面之間的電子轉(zhuǎn)移的介質(zhì)由初期的聚合物電介體和殘余VFc單體逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)閱为?dú)由聚合物電介體來(lái)完成二者之間的電子轉(zhuǎn)移，表現(xiàn)出的催化電流密度由高向低直至達(dá)到穩(wěn)定值的轉(zhuǎn)變，從而降低了檢測(cè)數(shù)據(jù)的可靠性和重復(fù)性，因此合成產(chǎn)物需要對(duì)殘余的單體進(jìn)行清除。在去除殘余單體的方式上，Kuramoto等[35]采用反復(fù)洗滌與沉淀來(lái)除去殘留的VFc單體,該方法較為簡(jiǎn)易，但容易造成產(chǎn)物的流失。Liu等[36]則用沉淀和透析的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)殘余單體的去除，并用高效液相色譜法檢測(cè)透析后殘留單體的含量，在一定程度上降低了產(chǎn)物的流失。

4 結(jié)論

VFc氧化還原電位較低，且呈現(xiàn)出良好的電化學(xué)可逆性，因此由VFc合成的聚合物電介體被廣泛的用于生物傳感器的修飾。VFc自由基聚合過(guò)程中容易發(fā)生單分子終止反應(yīng)，即“分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移”，該反應(yīng)將使得鏈自由基失活和聚合物增長(zhǎng)鏈提前終止，從而降低了聚合物分子量，一些學(xué)者提出溶劑效應(yīng)和位阻效應(yīng)可能是導(dǎo)致該反應(yīng)發(fā)生的主要原因。在酶電極的電化學(xué)表征方法中，循環(huán)伏安法是較為常用的分析方法。但是，在利用該修飾電極檢測(cè)分析物濃度之前，需要對(duì)檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化，以提高修飾電極的靈敏度和穩(wěn)定性。