王 丹， 萬慧慧， 張 華

(精細(xì)化工國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連理工大學(xué)，遼寧大連 116024)

二十二碳六烯酸(DHA)是Omega-3多不飽和脂肪酸，它能健腦明目，在預(yù)防心腦血管疾病、抑制腫瘤生長、抗炎及抑制過敏反應(yīng)等方面也有一定作用[1]。國內(nèi)外對(duì)DHA的樣品前處理方法有超聲提取(UE)[2]、液液萃取(LLE)[3]、固相萃取(SPE)[4,5]和超臨界流體萃取(SFE)[6]等。SPE能同時(shí)完成樣品的富集與純化，相比UE和LLE提高了檢測(cè)的靈敏度，適合批量處理樣品，重現(xiàn)性好，且成本較低。Andréina等[4]和Ruiz[5]等考察了正相SPE柱的萃取效果，本文則對(duì)正反兩相4種SPE柱進(jìn)行了比較。而對(duì)DHA的檢測(cè)方面,有氣相色譜法(GC)[7]、氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[8,9]、高效液相色譜法(HPLC)[10]、高效液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS)[11]等。由于DHA的極性較強(qiáng)、揮發(fā)性較低，進(jìn)氣相檢測(cè)需要進(jìn)行衍生化處理，而采用液相檢測(cè)卻可以免去衍生化過程。許倩等[12]雖使用了LC-MS/MS檢測(cè)，但其未加碰撞能量，子離子仍然選擇母離子，而且僅使用LLE純化。

本文利用流動(dòng)注射法對(duì)質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定了最佳的定量子離子和碰撞能量，并選取C18 SPE小柱對(duì)血漿樣品進(jìn)行富集和純化，提高了靈敏度。結(jié)合HPLC-MS/MS在選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)模式下進(jìn)行分析，降低了基質(zhì)干擾，提高了檢測(cè)準(zhǔn)確度和靈敏度。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Thermo TSQ Quantum Ultra型三重四極桿液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國，Thermo公司)；KH-3200B型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；Milli-Q純水系統(tǒng)(美國，Millipore公司)；Vac Elut SPS 24真空裝置(美國，Agilent公司)；C18 SPE、C18SAX、Silica、NH2SPE小柱(北京華譜新創(chuàng)科技有限公司)。

二十二碳六烯酸(DHA，分析純，Nu-CHEK PREP INC)；2，6-二叔丁基對(duì)甲酚(BHT，分析純，國研集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；二氯甲烷、正己烷和甲醇(分析純，北京化工廠)；乙腈(色譜純，德國Merck KGaA公司)；甲酸(色譜純，美國DikmaPure公司)。實(shí)驗(yàn)用水取自Milli-Q純水系統(tǒng)。

大白鼠取自大連醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液和標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制稱取DHA標(biāo)準(zhǔn)品12.5 mg于50 mL棕色容量瓶中，加入25 mg BHT,用甲醇配成濃度為250 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱。移取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制成DHA濃度分別為0.10、0.20、2.0、10.0、20.0、60.0 μg/mL的80%甲醇水溶液為標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

1.2.2樣品預(yù)處理反相SPE小柱：準(zhǔn)確移取200 μL的大鼠血漿置于10 mL試管中,依次加入200 μL含有0.05%抗氧化劑BHT 的甲醇溶液、3 mL水，震蕩均勻?；罨謩e采用5 mL甲醇和5 mL 10%的甲醇水溶液依次淋洗C18和C18SAX SPE小柱。將上述樣品過小柱后，用2 mL 10%的甲醇水溶液潤洗樣品試管后再淋洗小柱，真空干燥5 min，再用5 mL甲醇溶液(含2%甲酸)洗脫至10 mL試管中，氮?dú)獯蹈?，?0%的甲醇水溶液定容至0.5 mL。正相SPE小柱：準(zhǔn)確移取200 μL的大鼠血漿置于10 mL試管中,依次加入200 μL含有0.05%抗氧化劑BHT的甲醇溶液、3 mL正己烷，震蕩均勻。活化分別采用5 mL二氯甲烷和5 mL正己烷依次淋洗Silica和NH2SPE小柱。將上述樣品過小柱后，用2 mL正己烷潤洗樣品試管后再淋洗小柱，真空干燥5 min，再用1 mL甲醇和5 mL二氯甲烷的混合液(含2%甲酸)洗脫至10 mL試管中，氮?dú)獯蹈?，?0%甲醇水溶液定容至0.5 mL。

1.3 儀器條件

1.3.1色譜條件色譜柱：Thermo C18柱(100×2.1 mm，3 μm)；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：0.2%甲酸水溶液-乙腈(體積比20∶80)；流速：200 μL/min。

1.3.2質(zhì)譜條件電噴霧電離源(ESI)，負(fù)離子掃描選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)(SRM)模式，噴霧電壓2.5 kV，氣化溫度40 ℃，鞘氣12 L/min，輔助氣10 L/min，離子傳輸管溫度340 ℃。SRM的質(zhì)譜條件見表1。

表1 DHA的MRM質(zhì)譜檢測(cè)條件

*Quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 LC-MS/MS條件的優(yōu)化

圖1 (a)5 μg/mL DHA標(biāo)樣的SRM掃描圖；(b)經(jīng)SPE柱純化和經(jīng)LLE純化(c)的大鼠血漿中DHA的SRM掃描圖Fig.1 (a)SRM scan chromatogram of 5 μg/mL of DHA standard；SRM scan chromatogram of DHA in the plasma of rats purified with the SPE column (b) and purified with LLE (c)

優(yōu)化液相色譜條件，有機(jī)相選擇80%體積的乙腈，可在5 min內(nèi)出峰，同時(shí)DHA峰與雜質(zhì)峰能實(shí)現(xiàn)很好的分離，也沒有樣品殘留。在水相中添加0.2%的甲酸，可防止DHA色譜峰峰形變差。

利用流動(dòng)注射法對(duì)質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，DHA結(jié)構(gòu)中有-COOH，在負(fù)離子模式下有較好響應(yīng)，對(duì)碰撞能量的優(yōu)化結(jié)果見表1。大鼠血漿中DHA經(jīng)C18 SPE柱純化的SRM掃描圖，及經(jīng)LLE[3](用氯仿提取)純化得到的SRM掃描圖見圖1。結(jié)果表明，樣品經(jīng)LLE純化得到的SRM掃描圖背景噪音比較大，會(huì)影響定量的準(zhǔn)確度，而經(jīng)C18 SPE柱富集純化后則可以明顯降低背景噪音，使結(jié)果更準(zhǔn)確可靠。

2.2 前處理凈化條件的優(yōu)化

考察了C18(6 mL/500mg)、C18SAX(3 mL/100mg)、硅膠柱(Silica，6 mL/500mg)和NH2柱(6 mL/1g)4種SPE小柱對(duì)DHA凈化回收效果，結(jié)果見表2。C18SAX柱是強(qiáng)陰離子交換小柱，鍵合的季氨基可以與DHA在水中形成的羧基(-COO-)發(fā)生選擇性吸附，難以洗脫完全，故回收率很低，只有58.0%；NH2柱是以硅膠為基質(zhì)的氨丙基萃取柱，它具有極性固定相和弱陰離子交換劑，當(dāng)用在非極性溶液中進(jìn)行預(yù)處理時(shí)，它能與帶有-OH、-NH、-SH官能團(tuán)的分子形成氫鍵，雖然也有一定的死吸附，但NH2柱與陰離子的作用較C18SAX弱，因此回收率比C18SAX相對(duì)高一些為82.8%；Silica柱是未經(jīng)鍵合的高純氧化硅(SiO2)，是強(qiáng)極性吸附劑，具有一定的酸性，作用機(jī)理為氫鍵或者偶極相互作用，與同樣偏酸性的DHA作用力則較差些，上樣濃度增大，可能會(huì)發(fā)生穿透現(xiàn)象，本文在30 μg/mL加標(biāo)濃度時(shí)，發(fā)生了少許穿透，回收率為90.1%，比預(yù)期偏低了一些；C18柱是在高純硅膠基質(zhì)上鍵合了碳十八烷基，對(duì)大多數(shù)有機(jī)物都有保留，是應(yīng)用最為廣泛的SPE柱，對(duì)DHA的作用力也相對(duì)較合適，回收率為103.3%，是4種小柱中最適合富集DHA的SPE柱。

表2 4種SPE小柱對(duì)DHA的凈化回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)

比較C18和Silica SPE小柱的穿透性：分別采集樣品加標(biāo)濃度為2、10、30、60 μg/mL時(shí)過兩SPE小柱后的上樣液，吹干定容后檢測(cè)。結(jié)果在加標(biāo)濃度為30 μg/mL時(shí)，Silica SPE柱發(fā)生少許穿透，C18 SPE柱在60 μg/mL時(shí)仍沒有穿透。綜合考量回收率和穿透性，選擇C18 SPE小柱對(duì)DHA進(jìn)行富集純化。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1線性范圍與檢出限將配制好的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液用LC-MS/MS測(cè)定， DHA的濃度在0.10～60.0 μg/mL范圍內(nèi)線性良好，線性方程為：y=14867x+9205.8，r2=0.9990，逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定方法的檢出限(LOD，以S/N=3計(jì))為0.04 μg/mL，定量限(LOQ，以S/N=10計(jì))為0.10 μg/mL。檢出限和定量限較低，可以滿足血漿中DHA含量的分析要求。

表3 回收率和精密度測(cè)定結(jié)果(n=6)

2.3.2方法的回收率和精密度采用血漿樣品為基質(zhì)進(jìn)行回收率和精密度試驗(yàn)。在樣品中添加3個(gè)濃度水平(2、10、30 μg/mL)的DHA標(biāo)準(zhǔn)溶液，按本文方法進(jìn)行富集和檢測(cè)，每個(gè)添加水平平行測(cè)定6次，計(jì)算平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。平均回收率范圍為94.0%～107%，RSDs在2.15%～3.12%之間(表3)，方法的回收率和精密度均較好。

2.3.3重復(fù)性和穩(wěn)定性平行取6份大鼠血漿樣品，經(jīng)過SPE柱富集純化后，制備6份供試品溶液，按照本文方法進(jìn)行LC-MS/MS檢測(cè)，測(cè)得DHA含量的RSD為3.68%(n=6)，方法重復(fù)性較好。將上述6份供試品溶液，放置在冰箱中-20 ℃保存，經(jīng)1、2、3 d后分別再次進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)得6份溶液中DHA含量的RSDs范圍在2.24%～4.13%之間，結(jié)果表明，樣品在-20 ℃保存至少可以穩(wěn)定3 d。

2.4 實(shí)際樣品測(cè)定

取10份不同批次的大鼠血漿樣品各200 μL，按文中方法進(jìn)行C18 SPE柱富集和檢測(cè)，結(jié)果表明，這些大鼠血漿中DHA濃度在1.12～2.05 μg/mL之間，因此本方法線性范圍可滿足實(shí)際樣品分析。

3 結(jié)論

本文選擇C18 SPE小柱對(duì)大鼠血漿樣品進(jìn)行富集和純化，結(jié)合HPLC-MS/MS在SRM模式下對(duì)DHA進(jìn)行分析，降低了基質(zhì)干擾，避免了氣相色譜的衍生化過程，提高了檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度。由于脂肪酸的結(jié)構(gòu)相似，該方法有望用于人體或大鼠等動(dòng)物血漿中多種脂肪酸含量的同時(shí)分析；另外動(dòng)物的腦、肝、眼、心臟等部位樣品經(jīng)勻漿和溶劑粗提后，也可應(yīng)用此方法測(cè)定其中的脂肪酸含量。