蔡志芳, 劉計(jì)敏, 鄭崇濤, 高永平, 郭滿棟

(山西師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，山西臨汾 041004)

本文采用簡(jiǎn)便、快捷的滴涂方法，將葡萄糖氧化酶(GOD)滴涂在鈉米金(Nano -Au)、殼聚糖(CS)、離子液體1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽(BMIMPF6)復(fù)合膜修飾的金電極表面，制備了一種新型葡萄糖生物傳感器。研究了該傳感器的制作方法、最佳實(shí)驗(yàn)條件及電極表面的電子轉(zhuǎn)移機(jī)理。該傳感器具有制作簡(jiǎn)單，靈敏度高，穩(wěn)定性好的特點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

LK2005A型電化學(xué)工作站(天津蘭力科電子高科技有限公司)，三電極體系：裸金電極及修飾電極為工作電極，Ag/AgCl(飽和KCl)電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極。JB-2定時(shí)雙向磁力加熱攪拌器(江蘇金壇市金城國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠)；雷磁PXSJ-216型離子計(jì)(上海精科)；KQ-250B型超聲波清洗器(昆侖市超聲波儀器制造廠)。

1%檸檬酸鈉儲(chǔ)備溶液：稱取1.0101 g檸檬酸鈉，溶解并定容至100 mL棕色容量瓶中，4 ℃下避光保存。K3[Fe(CN)6]、K4[Fe(CN)6]、KNO3(0.4 mol·L-1)儲(chǔ)備溶液：分別稱取0.0827 g K3[Fe(CN)6]、0.1061 g K4[Fe(CN)6]、10.21 g KNO3，溶解并定容至250 mL容量瓶中，4 ℃下避光保存。殼聚糖(CS)儲(chǔ)備溶液：將0.004 g CS溶于0.2 mL冰乙酸，稀釋至1 mL，在超聲波清洗器中超聲至完全溶解。葡萄糖氧化酶(GOD)儲(chǔ)備溶液：稱取0.05 mg GOD(美國Sigma)，用二次蒸餾水稀釋，并定容至10 mL容量瓶中，4 ℃下避光保存。H2SO4:0.5 mol·L-1。離子液體1-丁基-3甲基咪唑六氟磷酸鹽(BMIMPF6)，D -葡萄糖，Na2HPO4，NaH2PO4。所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1納米金溶膠的制備按照文獻(xiàn)報(bào)道方法[13]，稱取0.01607 g HAuCl4溶于50 mL水中，并在磁力攪拌器上攪拌加熱至沸騰后，加入1.5 mL 1%的檸檬酸鈉溶液，繼續(xù)在沸騰情況下攪拌15～30 min，待溶液由藍(lán)色變?yōu)榫萍t色時(shí)即形成納米金溶膠。移去熱源后繼續(xù)攪拌10 min，在室溫下冷卻后，將制備好的納米金溶膠置于棕色試劑瓶中，于冰箱中4 ℃保存待用。

1.2.2金電極的預(yù)處理將金電極用Al2O3粉拋光，分別在二次水、無水乙醇、丙酮、硝酸(1+1)、二次水中各超聲5 min，并重復(fù)3次，然后將電極置于0.5 mol·L-1的H2SO4中用循環(huán)伏安法(電位區(qū)間：-0.4～1.5 V，掃速：0.1 V·s-1)活化處理，除去清洗過程中電極表面殘留的微量雜質(zhì)，最后將其用氮?dú)獯蹈?，待用?/p>

1.2.3化學(xué)修飾電極的制備Nano -Au/CS/BMIMPF6/Au電極的制備：用微型進(jìn)樣器移取10 μL BMIMPF6于上述CS儲(chǔ)備液中，在超聲波清洗器中超聲至完全溶解，然后用移液槍移取一定量(200 μL)新配制的Nano -Au溶膠于CS與離子液體BMIMPF6的混合溶液中，再次超聲混勻，最后用微型進(jìn)樣器取5 μL該混合溶液滴涂在預(yù)處理好的金電極表面，于室溫下晾干。

GOD/Nano -Au/CS/BMIMPF6/Au電極的制備：在溫度4 ℃下，將制備好的Nano -Au/CS/BMIMPF6/Au電極浸泡在5.0 mg·mL-1GOD中，浸泡4 h，或者將GOD氧化酶滴涂到Nano -Au/CS/BMIMPF6/Au電極表面，即制得GOD/Nano -Au/CS/BMIMPF6/Au電極(12 h后使用)。

1.2.4實(shí)驗(yàn)方法采用三電極體系，在磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中進(jìn)行了電化學(xué)測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 修飾電極的表征

2.1.1掃描電鏡表征圖1是用滴涂法修飾的各種修飾電極表面的掃描電鏡(SEM)圖。從圖1(A)中可以看出， CS呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。從圖1(B)中可以看出，Nano -Au、BMIMPF6在CS上分散均勻、質(zhì)地緊密。從圖1(C)中可以看出，GOD與Nano -Au、BMIMPF6、CS牢固的結(jié)合，說明GOD能夠很好地固載在修飾電極表面。

圖1 CS(A)，Nano -Au/CS/BMIMPF6(B)，GOD -Nano -Au/CS/BMIMPF6(C)的掃描電鏡(SEM)圖Fig.1 SEM images of CS(A),Nano -Au/CS/BMIMPF6(B) and GOD -Nano -Au/CS/BMIMPF6(C)

2.2 GOD -Nano -Au/CS/BMIMPF6/Au電極的電化學(xué)行為

圖3是GOD -Nano -Au/BMIMPF6/CS/Au修飾電極分別在濃度為1.0×10-4mol·L-1葡萄糖溶液(曲線a)和空白溶液(曲線b)中的循環(huán)伏安圖。從圖中可以看出在加入葡萄糖溶液后出現(xiàn)了一對(duì)較靈敏的氧化還原峰，說明建立了保持生物活性的微環(huán)境，使制備的生物傳感器有較高的靈敏度。在曲線b中還原峰Ⅰ和氧化峰Ⅱ的峰電位和峰電流分別為：EpⅠ=-0.0087 V(ipⅠ=47.6215 μA)，EpⅡ=0.4789 V(ipⅡ=11.2051 μA)，其△E=EpⅡ-EpⅠ=0.4702 V，ipⅠ/ipⅡ=4.25≠1，由此可知，葡萄糖在GOD -Nano -Au/BMIMPF6/CS/Au電極上的電極反應(yīng)過程是不可逆過程。

圖2 不同電極在溶液中的循環(huán)伏安圖Fig.2 Cyclic voltammograms of different electrodes in solution(a)Bare gold electrode；(b)CS/Au；(c) BMIMPF6/CS/Au；(d)Nano -Au/BMIMPF6/CS/Au;(e)GOD/Nano Au/CS/BMIMPF6/Au.scan rate:0.1 V·s-1.

圖3 GOD -Nano -Au/CS/BMIMPF6/Au在葡萄糖(a)與空白溶液(b)中的循環(huán)伏安圖Fig.3 Cyclic voltammograms of GOD -Nano -Au/CS/BMIMPF6/Au in glucose(a)and blank solution(b)scan rate:0.1 V·s-1.

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.3.1底液及其pH值的選擇用循環(huán)伏安法分別考察了GOD -Nano -Au/BMIMPF6/CS/Au電極在PBS(pH=7.1)、KH2PO4-Na2B4O7(pH=7.4)、Na2B4O7-HCl(pH=8.8)、Na2B4O7-NaOH(pH=10.2)等支持電解質(zhì)中的電化學(xué)行為。采用三電極體系，在-0.4～1.5 V的電位范圍內(nèi)，以0.1 V·s-1的掃描速率進(jìn)行循環(huán)伏安掃描。研究表明，在PBS中的循環(huán)伏安圖峰形良好，峰電流高、背景電流低，所以最終選擇PBS為底液。

用循環(huán)伏安法測(cè)定修飾電極置于不同pH值的PBS底液中峰電流的變化情況。結(jié)果表明，pH值不同時(shí)對(duì)應(yīng)的峰電流的大小明顯不同。當(dāng)pH≤7.1時(shí)，峰電流隨著pH值的增加而增加；當(dāng)pH>7.1隨著pH值的增加，峰電流反而減小。在pH值為7.1的PBS中，GOD -Nano -Au/BMIMPF6/CS/Au修飾電極對(duì)葡萄糖的響應(yīng)最好，其氧化還原峰的峰形最好，且相應(yīng)的峰電流也是最高的。所以本實(shí)驗(yàn)選用pH值為7.1的PBS為底液。

2.3.2離子液體濃度及富集時(shí)間的選擇在Nano -Au和CS的混合液中,分別加入不同量的BMIMPF6(1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 μL)，結(jié)果表明加入10 μL時(shí)，Nano -Au、CS和BMIMPF6三者能夠互溶，且峰電流最高。在選定的實(shí)驗(yàn)條件下，改變富集時(shí)間(0～350 s)，結(jié)果表明隨著富集時(shí)間的增加，峰電流幾乎呈直線增加。當(dāng)富集時(shí)間達(dá)到180 s時(shí)，峰電流增加緩慢，說明電極表面的吸附趨于飽和，故選擇富集時(shí)間為180 s。

圖4 GOD -Nano -Au/BMIMPF6/CS/Au電極在不同掃速下的循環(huán)伏安圖Fig.4 Cyclic voltammograms of GOD -Nano -Au/CS/BMIMPF6/Au at different scan ratescan rate(a→k):0.05,0.07,0.09,0.11,0.13,0.15,0.17,0.19,0.21,0.23,0.25 V·s-1.

2.3.3掃描速率的影響圖4是GOD/Nano-Au/CS/BMIMPF6/Au修飾電極在不同掃速下的循環(huán)伏安圖，隨著掃速的增加，陽極峰電位正移，陰極峰電位負(fù)移，氧化還原峰電位差△Ep也逐漸增大。在0.05～0.25 V·s-1掃速范圍內(nèi)，掃速平方根(v1/2)與峰電流呈線性關(guān)系，說明葡萄糖在GOD -Nano -Au/BMIMPF6/CS/Au電極上是受擴(kuò)散控制的反應(yīng)過程，從而可得出此反應(yīng)是一個(gè)不可逆反應(yīng)，其回歸方程為：ipc=198.55v1/2-19.764(ipc：μA；v：V·s-1)，r=0.9976。掃速在0.05～0.25 V·s-1范圍，還原峰電流與掃速的對(duì)數(shù)呈良好線性。Epc-lgv的線性方程為：Epc=-0.0602lgv+0.0381，r=0.9687。通過做塔菲爾曲線可知：峰電位與還原峰電流的對(duì)數(shù)值的線性方程為：E(V)=-0.1817lgIp(A)-0.0878，r=0.9990。

由上可得α=0.1817，代入Epc-lgv方程的斜率(0.5×2.303RT×(anF)-1)可得n≈2。由此可知，葡萄糖在GOD -Nano -Au/BMIMPF6/CS/Au修飾電極上發(fā)生了兩個(gè)電子交換的氧化還原反應(yīng)。

2.4 線性范圍和檢出限

用線性溶出伏安掃描法研究了GOD -Nano -Au/CS/BMIMPF6/Au電極在不同濃度葡萄糖溶液中的線性關(guān)系。結(jié)果表明，該傳感器對(duì)葡萄糖濃度在1.0×10-4～1.0×10-6mol·L-1范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，其線性方程為：y=0.0871x+37.889(r=0.9995)。在選定實(shí)驗(yàn)條件下，檢出限為3.85×10-8mol·L-1，說明該方法靈敏度較高。

2.5 穩(wěn)定性和重現(xiàn)性

同時(shí)制備5支GOD -Nano -Au/BMIMPF6/CS/Au電極，分別對(duì)1.0×10-5mol·L-1葡萄糖溶液進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定3次，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為4.51%。用同一電極對(duì)1.0×10-5mol·L-1葡萄糖溶液進(jìn)行平行測(cè)定10次，RSD為3.26%，說明GOD -Nano -Au/BMIMPF6/CS/Au電極的重現(xiàn)性較好。

將制備好的GOD -Nano -Au/BMIMPF6/CS/Au電極儲(chǔ)存在4 ℃下，放置兩周后進(jìn)行測(cè)定，其響應(yīng)性能基本保持不變，一個(gè)月后，電極響應(yīng)性能是原始的88.3%，說明GOD -Nano -Au/BMIMPF6/CS/Au電極的穩(wěn)定性較好。

2.6 干擾試驗(yàn)及回收率

最佳實(shí)驗(yàn)條件下，在濃度為1.0×10-5mol·L-1的葡萄糖溶液中，分別加入10倍的尿酸(UA)、抗壞血酸(AA)，200倍的Ca2+、Mg2+、K+、Zn2+時(shí)，測(cè)定其對(duì)葡萄糖生物傳感器響應(yīng)信號(hào)的干擾。結(jié)果表明，這些物質(zhì)均無明顯干擾。說明GOD -Nano -Au/BMIMPF6/CS/Au電極對(duì)葡萄糖有很好的選擇性。

選取pH=7.1的PBS為測(cè)試底液，分別向底液中加入3個(gè)濃度的葡萄糖溶液，用制備好的葡萄糖傳感器測(cè)定其響應(yīng)電流變化值。結(jié)果表明，葡萄糖傳感器有較好回收率，見表1。

表1 測(cè)試結(jié)果及方法的回收率

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用金電極為基體電極，在金電極表面滴涂由Nano -Au、CS和 BMIMPF6制備的復(fù)合材料，然后再將GOD修飾到Nano -Au/BMIMPF6/CS/Au電極表面，制得了一種新的葡萄糖生物傳感器。由于幾種修飾物的共同作用，使得制得的傳感器具有響應(yīng)速度快、靈敏度高、穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)。