陳云鵬 王 磊 童亞林 劉 亮 呂 璐 莫永亮 詹 球 陽(yáng)齊瓊 梁 靜 朱富軍 龔震宇 辛海明

(1.廣西師范大學(xué)研究生培養(yǎng)基地暨解放軍第一八一醫(yī)院燒傷整形科， 廣西 桂林 541002；2.解放軍第一八一醫(yī)院燒傷整形科， 廣西 桂林 541002； 3.解放軍第一八一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心、廣州軍區(qū)燒傷整形中心實(shí)驗(yàn)室， 廣西 桂林 541002)

·論 著·

人羊膜勻漿上清液對(duì)脂多糖致傷的大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及分泌炎癥因子的影響

陳云鵬1王 磊1童亞林2劉 亮3呂 璐1莫永亮1詹 球3陽(yáng)齊瓊3梁 靜3朱富軍2龔震宇2辛海明2

(1.廣西師范大學(xué)研究生培養(yǎng)基地暨解放軍第一八一醫(yī)院燒傷整形科， 廣西 桂林 541002；2.解放軍第一八一醫(yī)院燒傷整形科， 廣西 桂林 541002； 3.解放軍第一八一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心、廣州軍區(qū)燒傷整形中心實(shí)驗(yàn)室， 廣西 桂林 541002)

目的：探討人羊膜勻漿上清液(hAHS)對(duì)脂多糖(LPS)致傷的大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(RPMVECs)增殖及其分泌促炎因子的影響。方法：用新鮮人羊膜制備hAHS，用考馬斯亮藍(lán)法和ELISA法分別測(cè)定hAHS中總蛋白和表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、白介素-4(IL-4)、IL-10、血管生成素-1(Ang-1)、人β-防御素2(HBD2)的含量。MTT法檢測(cè)不同體積分?jǐn)?shù)hAHS(0、10%、15%、20%、25%)作用于RPMVECs后細(xì)胞增殖活性的變化，確定hAHS促進(jìn)RPMVECs增殖的最佳濃度。根據(jù)共培養(yǎng)條件不同，將RPMVECs隨機(jī)分為4組：N組(10%FBS+DMEM/F12)，A組(10%FBS+DMEM/F12+15%hAHS)，B組(10%FBS+DMEM/F12+LPS)和C組(10%FBS+DMEM/F12+15%hAHS+LPS)。各組細(xì)胞在干預(yù)后0、12、24、48、72 h用MTT法測(cè)定吸光度值(A值)，并分別于培養(yǎng)6、8、10、12、24 h時(shí)用ELISA法測(cè)定RPMVECs培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-6、IL-8的含量。結(jié)果：hAHS中總蛋白濃度為(725.125±12.625)mg/L，其中EGF、bFGF、VEGF、IL-4、IL-10、Ang-1、HBD2的濃度分別為(504.785±4.665)、(4.426±0.138)、(0.185±0.006)、(25.650±4.104)、(13.733±2.197)、(15.561±0.496)和(4.763±0.714)ng/L。hAHS的體積分?jǐn)?shù)在10%～20%時(shí)均具有促進(jìn)RPMVECs增殖的作用且以15%hAHS培養(yǎng)后第7、9天的增殖率最佳，而25%hAHS在第7、9、11天使RPMVECs增殖率小于0%hAHS組(P<0.05)。A組48和72 h細(xì)胞增殖活性較N組顯著增加，B組24、48和72 h的增殖活性較N組顯著降低；C組24、48和72h的增殖活性較B組顯著升高(P<0.05)。ELISA結(jié)果顯示，B組各時(shí)間點(diǎn)的IL-6和TNF-α的含量以及8、10、12和24 h的IL-8含量均顯著高于N組(P<0.05)；C組10和12 h的IL-6含量，8、10、12和24 h的IL-8含量及各時(shí)間點(diǎn)的TNF-α含量均顯著低于B組(P<0.05)。結(jié)論：hAHS含有促進(jìn)組織修復(fù)、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、降低血管通透性及殺傷致病微生物的多種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子，對(duì)LPS致傷的RPMVECs增殖具有促進(jìn)作用，并減少致傷后炎癥因子分泌。

人羊膜勻漿上清液 大鼠 肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞 脂多糖 細(xì)胞增殖 肺損傷，急性

肺部革蘭陰性(G-)菌感染是臨床上嚴(yán)重?zé)齻绕浜喜⒅囟任胄該p傷氣管切開(kāi)患者最常見(jiàn)的并發(fā)癥，G-菌壁上的主要成分脂多糖(LPS)通過(guò)損傷肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞引起肺血管通透性增加并導(dǎo)致急性肺損傷(ALI)。有關(guān)應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)治療ALI的研究結(jié)果表明，MSCs通過(guò)旁分泌多種細(xì)胞因子參與損傷細(xì)胞的修復(fù)、減輕炎癥反應(yīng)等是其治療ALI的作用機(jī)制之一[1-2]。人羊膜的上皮細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞同樣具有干細(xì)胞特性，可向3個(gè)胚層分化并能分泌具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子。本實(shí)驗(yàn)中采用LPS致大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(RPMVECs)損傷模型，觀察人羊膜勻漿上清液(hAHS)對(duì)LPS損傷后RPMVECs增殖及分泌炎癥因子的影響，報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人羊膜組織來(lái)源于本院婦產(chǎn)科產(chǎn)婦，均簽署了知情同意書(shū)，并經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。選取產(chǎn)前檢查人類(lèi)免疫缺陷病毒、乙肝病毒、丙肝病毒及梅毒病毒均為陰性產(chǎn)婦的足月齡胎膜6個(gè)，產(chǎn)后立即將胎膜放入無(wú)菌生理鹽水中。SD大鼠RPMVECs細(xì)胞株(購(gòu)于武漢原生原代(PriCells)生物醫(yī)藥科技有限公司)，錐蟲(chóng)藍(lán)(美國(guó)Amresco公司)，LPS(美國(guó)Sigma公司)，DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清(北京Thermo生物化學(xué)制品有限公司)，胰蛋白酶(安徽合肥博美生物科技有限公司)，甲基噻唑基四唑(MTT，Sigma-Aldrich中國(guó)有限公司)，二甲基亞砜(DMSO，上海偉進(jìn)生物科技有限公司)；人表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、血管生成素1(Ang-1)、IL-4、IL-10和人β-防御素2(HBD2) ELISA試劑盒,大鼠TNF-α、IL-6和IL-8 ELISA試劑盒(美國(guó)R&D公司)。紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(UV-3100，Mapada公司)；96孔培養(yǎng)板(Corning Incorporated公司)；酶標(biāo)儀(BIO-RAD公司)； 0.02 μm細(xì)菌過(guò)濾器(Millex-GP公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 人羊膜制備及其勻漿上清液的提取 按文獻(xiàn)[3]的方法，胎膜用無(wú)菌生理鹽水洗凈殘留的血塊后放入抗生素溶液(50 mg/L青霉素、50 mg/L鏈霉素和2.5 mg/L兩性霉素B)中浸泡10 min。浸泡過(guò)程中，通過(guò)羊膜與絨毛膜間的間隙鈍性分離獲取羊膜。獲取的羊膜用PBS漂洗3次，按文獻(xiàn)[4]方法在羊膜上隨機(jī)取一小部分，錐蟲(chóng)藍(lán)直染法鑒定其細(xì)胞活力。選取細(xì)胞活力大于95%的人羊膜剩余部分，用眼科剪剪成約1 mm×1 mm碎片，混和均勻后分成兩份。一份按1:1的體積加入無(wú)血清的DMEM/F12，然后按照本課題組的方法[5]制備成含DMEM/F12的hAHS，用于細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。另一份人羊膜處理方法同上，但以PBS代替DMEM/F12，制成含PBS的hAHS，用于hAHS中總蛋白以及細(xì)胞因子濃度檢測(cè)。將制得的hAHS經(jīng)細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾后分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?.2.2 hAHS中總蛋白及不同因子濃度的測(cè)定 取含PBS的hAHS，hAHS中蛋白濃度采用考馬斯亮藍(lán)G-250試劑盒測(cè)定。hAHS中EGF、bFGF、VEGF、Ang-1、IL-4、IL-10、HBD2的濃度測(cè)定采用ELISA試劑盒，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)步驟操作。

1.2.3 RPMVECs增殖率的測(cè)定 用含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)原代RPMVECs，傳至第2代，以1×104個(gè)/ml的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200 μl，根據(jù)hAHS在培養(yǎng)基中的體積分?jǐn)?shù)不同(0、10%、15%、20%、25%)分為5組，分別與含相應(yīng)體積分?jǐn)?shù)hAHS的培養(yǎng)基孵育，每組設(shè)10個(gè)孔。孵育24 h后棄培養(yǎng)液，隔天換液。在孵育后第0、1、3、5、7、9、11天采用MTT法檢測(cè)每孔的吸光度(A)值。檢測(cè)時(shí)每孔加入MTT 20 μl，在體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)，4 h后棄培養(yǎng)液，每孔加150 μl DMSO，37 ℃振蕩孵育10 min，酶標(biāo)儀測(cè)A630值。測(cè)定結(jié)果取平均值，繪制RPMVECs生長(zhǎng)曲線，計(jì)算細(xì)胞增殖率：細(xì)胞增殖率=[(實(shí)驗(yàn)組A值-0%hAHS組A值)/0%hAHS組A值]×100%。

1.2.4 LPS致傷的RPMVECs細(xì)胞增殖活性測(cè)定 取培養(yǎng)的第1代RPMVECs，隨機(jī)分為4組：N組(10%FBS+DMEM/F12)，A組(10%FBS+DMEM/F12+15%hAHS)，B組(10%FBS+DMEM/F12+LPS)和C組(10%FBS+DMEM/F12+15%hAHS+LPS)。以4×104個(gè)/ml密度將RPMVECs接種于96孔板中，每孔200 μl，按照實(shí)驗(yàn)分組更換為相應(yīng)培養(yǎng)基，LPS濃度40 μg/ml，用DMEM/F12溶解。0、12、24、48、72 h后棄去，每孔加入MTT 20 μl，繼續(xù)放置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，棄液，每孔加入DMSO 150 μl，37 ℃振蕩孵育15 min，酶標(biāo)儀測(cè)定A630值。1.2.5 LPS致傷的RPMVEC炎癥因子分泌的測(cè)定 取培養(yǎng)的第1代SD大鼠RPMVECs，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至80%后消化并制成細(xì)胞懸液，以4×104/mL密度接種于96孔板中，每孔200 μl，分組同1.2.4。在更換為相應(yīng)培養(yǎng)基6、8、10、12、24 h后收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液。按照ELISA試劑盒說(shuō)明檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6、IL-8、TNF-α的含量。

2 結(jié) 果

2.1 hAHS中總蛋白及各細(xì)胞因子濃度 hAHS中蛋白質(zhì)的濃度為(725.125±12.625)mg/L，EGF、bFGF、VEGF、Ang-1、IL-4、IL-10、HBD2的濃度分別為(504.785±4.665)ng/L，(4.426±0.138)ng/L，(0.185±0.006)ng/L，(15.561±0.496)ng/L，(25.650±4.104)ng/L，(13.733±2.197)ng/L，(4.763±0.714)ng/L。

2.2 不同體積分?jǐn)?shù)的hAHS對(duì)RPMVEC增殖活性和增殖率的影響

2.2.1 增殖活性的變化 各組A值在第1、3、5、7天均明顯高于前一次檢測(cè)結(jié)果(P<0.05)，在第11天明顯低于第9天(P<0.05)。10%hAHS組A值在第7、9、11天明顯大于0%hAHS組(P<0.05)。15%hAHS組A值在第5、7、9、11天明顯大于0%hAHS組(P<0.05)。25%hAHS組A值在第7、9、11天明顯小于0%hAHS組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2.2 細(xì)胞增殖率的變化 10%hAHS組僅第7天、15%hAHS組在第5、7天增殖率明顯大于0%hAHS組(P<0.05)。20%hAHS組在第9天、25%hAHS組在第7、9、11天的增殖率均明顯小于0%hAHS組(P<0.05)。各組其他時(shí)間增殖率與0%hAHS組相同時(shí)間點(diǎn)相比，差異無(wú)顯著性(P>0.05,表2)。

hAHS體積分?jǐn)?shù)培養(yǎng)時(shí)間(d)13579110%0.034±0.004*Δ0.048±0.006*Δ0.165±0.019*Δ0.650±0.113*Δ0.706±0.115*0.534±0.099*Δ10%0.035±0.007*Δ0.050±0.008*Δ0.171±0.018*Δ0.816±0.107*Δ#0.883±0.147*#0.703±0.098*Δ#15%0.035±0.005*Δ0.049±0.006*Δ0.188±0.025*Δ#0.894±0.158*Δ#0.965±0.172*#0.748±0.129*Δ#20%0.034±0.003*Δ0.049±0.006*Δ0.174±0.022*Δ0.750±0.132*Δ0.791±0.117*0.598±0.098*Δ25%0.035±0.006*0.049±0.008*0.164±0.031*0.545±0.097*Δ0.583±0.106*#0.326±0.059*Δ#

注：含0%hAHS培養(yǎng)基培養(yǎng)0 d時(shí)A值為0.027±0.006；與0%hAHS培養(yǎng)0 d比較；*P<0.05；與本組前一時(shí)間點(diǎn)比較：ΔP<0.05；與0%hAHS組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較；#P<0.05;hAHS體積分?jǐn)?shù)為0%組的標(biāo)本數(shù)為40孔，其余各組標(biāo)本數(shù)均為10孔。

hAHS體積分?jǐn)?shù)培養(yǎng)時(shí)間(d)13579110%0.285±0.0520.400±0.0822.438±0.4282.936±0.5680.086±0.013-0.244±0.03610%0.315±0.0620.425±0.0842.410±0.4653.785±0.679*0.083±0.011-0.204±0.02815%0.300±0.0600.412±0.0912.837±0.511*3.755±0.681*0.079±0.012-0.225±0.03020%0.289±0.0510.425±0.0922.557±0.5033.302±0.5820.055±0.010*-0.244±0.03025%0.307±0.0550.404±0.1232.341±0.3082.323±0.311*0.070±0.008*-0.442±0.058*

注：與0%hAHS組相同時(shí)間點(diǎn)比較：*P<0.05；hAHS體積分?jǐn)?shù)為0%組的標(biāo)本數(shù)為40孔，其余各組均為10孔

2.3 hAHS對(duì)LPS致傷的SD大鼠RPMVECs細(xì)胞活性的影響 MTT結(jié)果顯示，A組在第48、72 h的A值高于對(duì)照N組，B組從第24 h開(kāi)始A值低于對(duì)照N組，且一直持續(xù)至72 h，C組從第24 h開(kāi)始A值高于B組，且一直持續(xù)至72 h，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表3)。

組別標(biāo)本數(shù)(孔)培養(yǎng)時(shí)間(h)012244872N組36A組6B組6C組60.118±0.022———0.118±0.0210.126±0.0220.138±0.0250.175±0.0290.118±0.0240.132±0.0240.179±0.032*0.222±0.039*0.107±0.0190.102±0.017*0.099±0.016*0.101±0.017*0.122±0.0230.128±0.021Δ0.137±0.024Δ0.152±0.028Δ

注：與N組相同時(shí)間點(diǎn)比較：*P<0.05；與B組相同時(shí)間點(diǎn)比較：ΔP<0.05

2.4 hAHS對(duì)LPS致傷的RPMVECs分泌炎癥因子影響

2.4.1 IL-6 B組在各時(shí)間點(diǎn)IL-6的含量高于對(duì)照N組，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。C組各時(shí)間點(diǎn)IL-6的含量低于B組，但僅于10、12 h時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表4)。

2.4.2 IL-8 B組在8、10、12、24 h時(shí)IL-8的含量顯著高于對(duì)照N組(P<0.05)。C組在8、10、12、24 h時(shí)IL-8的含量顯著低于實(shí)驗(yàn)B組(P<0.05，表5)。

組別標(biāo)本數(shù)(孔)培養(yǎng)時(shí)間(h)68101224N組317.921±2.15118.517±2.21218.539±2.22519.878±2.38520.011±2.521A組319.854±2.58221.888±2.72720.326±2.43920.824±2.49922.814±2.738B組324.556±2.947*28.328±3.499*30.742±3.329*40.573±3.309*27.292±3.275*C組321.888±2.62723.400±2.86820.732±2.608Δ20.812±2.617Δ21.554±2.706

注：與N組相同時(shí)間點(diǎn)比較：*P<0.05；與B組相同時(shí)間點(diǎn)比較：ΔP<0.05

組別標(biāo)本數(shù)(孔)培養(yǎng)時(shí)間(h)68101224N組376.625±9.961076.138±10.028076.925±10.103075.925±9.870075.675±9.838A組374.425±9.675076.925±9.986075.533±9.819079.675±10.358076.425±9.935B組399.175±12.893113.515±13.067*115.225±14.979*123.675±14.908*111.325±14.472*C組385.675±11.138079.175±10.293Δ078.635±10.223Δ076.785±9.982Δ00074.5±9.685Δ

注：與N組相同時(shí)間點(diǎn)比較：*P<0.05；與B組相同時(shí)間點(diǎn)比較：ΔP<0.05

2.4.3 TNF-α B組在各時(shí)間點(diǎn)TNF-α的含量顯著高于對(duì)照N組(P<0.05)。C組在各時(shí)間點(diǎn)TNF-α的含量顯著低于B組(P<0.05，表6)。

組別標(biāo)本數(shù)(孔)培養(yǎng)時(shí)間(h)68101224N組3113.265±16.998114.115±17.117114.751±17.213115.324±17.299114.754±17.213A組3125.357±18.804124.286±18.643123.905±18.586122.310±18.346124.381±18.657B組3181.421±27.213*183.886±27.583*189.982±28.497*198.525±28.579*187.482±28.122*C組3126.476±19.971Δ127.224±19.084Δ128.714±19.307Δ130.476±19.571Δ129.667±19.475Δ

注：與N組相同時(shí)間點(diǎn)比較：*P<0.05；與B組相同時(shí)間點(diǎn)比較：ΔP<0.05

3 討 論

LPS是引起ALI常見(jiàn)因素之一，它通過(guò)直接與間接方式損傷RPMVECs和肺泡細(xì)胞，并以血管通透性增加、肺水腫作為最主要的特征性病理生理改變。隨著對(duì)干細(xì)胞治療ALI機(jī)制的深入研究，干細(xì)胞歸巢到肺損傷處的旁分泌作用逐漸為大家所關(guān)注[6]。研究指出，干細(xì)胞通過(guò)旁分泌的具有多種生物學(xué)作用的細(xì)胞因子參與了ALI的治療，如調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)與炎癥過(guò)程的促炎因子(IL-6、TNF-α)、抑炎因子(IL-4、IL-10)[7]、趨化因子(IL-8、CCL2、CCL4、CCL5、CCL20、CX3C亞族和CXC亞族)[8]等，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖與組織修復(fù)的EGF、bFGF、VEG等[9]，減輕RPMVECs損傷及通透性作用的Ang-1、KGF等[10]，具有一定抗病原菌作用的HBD2與抗菌多肽LL-37等[11]。與MSCs等干細(xì)胞相比，人羊膜干細(xì)胞具有弱抗原性、無(wú)悖倫理并可大量無(wú)創(chuàng)獲取的優(yōu)勢(shì)[12]。Hodges等[13]已證實(shí)人羊膜上皮細(xì)胞可減輕呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷并可分化為肺泡細(xì)胞，并應(yīng)用人羊膜干細(xì)胞開(kāi)展了防治博來(lái)霉素致肺纖維化的研究。Tan等[14]發(fā)現(xiàn)人羊膜上皮細(xì)胞可通過(guò)減少肺部巨噬細(xì)胞遷移和促進(jìn)巨噬細(xì)胞由M1向M2轉(zhuǎn)型來(lái)減輕肺損傷。本課題組開(kāi)展的hAHS對(duì)大鼠許旺細(xì)胞增殖作用研究結(jié)果證實(shí)，在hAHS中也含有多種促進(jìn)細(xì)胞增殖的生長(zhǎng)因子，并證明hAHS在一定濃度范圍內(nèi)具有明顯促進(jìn)大鼠許旺細(xì)胞增殖的作用。因此我們推測(cè)hAHS也能減輕LPS所致RPMVECs損傷，促進(jìn)其增殖，并與MSCs一樣可能也在ALI的防治方面發(fā)揮作用。

我們?cè)趆AHS中檢測(cè)出了具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)作用的EGF、bFGF、VEGF，并發(fā)現(xiàn)hAHS對(duì)體外培養(yǎng)的RPMVECs增殖具有促進(jìn)作用，且以體積濃度為15%的hAHS作用效果最好，而體積分?jǐn)?shù)為25%濃度時(shí)hAHS出現(xiàn)明顯抑制RPMVECs增殖現(xiàn)象。我們又觀察了15%hAHS對(duì)LPS損傷的RPMVEC增殖的影響，結(jié)果顯示，LPS與RPMVECs共培養(yǎng)后，LPS能明顯抑制RPMVECs的增殖，加入hAHS后可減輕LPS對(duì)RPMVECs的損傷、促進(jìn)其增殖，說(shuō)明hAHS具有促進(jìn)正常及LPS致傷的RPMVECs增殖的作用，hAHS分泌的EGF、bFGF、VEGF等多種生長(zhǎng)因子可能是其發(fā)揮作用的主要細(xì)胞因子之一。本研究結(jié)果為應(yīng)用hAHS促進(jìn)RPMVECs的損傷修復(fù)提供了依據(jù)。

LPS刺激RPMVEC分泌的TNF-α、IL-8和IL-6均是具有廣泛生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，而最為研究者關(guān)注的是其在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)過(guò)程中所具有的促炎作用，這些促炎因子通過(guò)活化免疫細(xì)胞并趨向損傷處集聚，參與包括RPMVECs與肺泡細(xì)胞在內(nèi)的其他組織細(xì)胞損傷與凋亡，并作為刺激因素又進(jìn)一步促進(jìn)多種細(xì)胞表達(dá)并分泌細(xì)胞因子，促進(jìn)、放大并導(dǎo)致失控的炎癥反應(yīng)，其中TNF-α是一種最強(qiáng)烈的早期致炎因子。本實(shí)驗(yàn)中，B組IL-6、TNF-α的含量在各觀察點(diǎn)均高于對(duì)照N組(P<0.05)，IL-8的含量在8、10、12、24 h高于對(duì)照N組(P<0.05)，說(shuō)明在LPS的刺激下RPMVECs分泌的炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-8、TNF-α含量增多，而當(dāng)加入hAHS后(C組),受LPS刺激的RPMVECs分泌上述炎癥細(xì)胞因子量在不同觀察點(diǎn)降低，提示hAHS對(duì)RPMVECs受到LPS刺激后分泌上述促炎因子具有抑制作用。

IL-4是一種多向免疫調(diào)節(jié)因子，能夠降低LPS激活的內(nèi)皮細(xì)胞促炎因子IL-6、TNF-α的表達(dá)[15]，IL-10具有較強(qiáng)的抗炎與免疫調(diào)節(jié)活性，對(duì)LPS引起的炎癥反應(yīng)有一定的抑制作用[16]；HBD2是一種陽(yáng)離子抗菌肽，對(duì)多種病原微生物(包括G+菌、G-菌、真菌等)均有強(qiáng)烈的直接殺傷作用，還能與LPS中和，且不會(huì)誘導(dǎo)耐藥菌株的產(chǎn)生[17]；Ang-1具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[18]并通過(guò)增加內(nèi)皮細(xì)胞之間連接的緊密性達(dá)到降低血管通透性的作用[19]。本研究結(jié)果顯示hAHS中也含有IL-4、IL-10、HBD2、Ang-1等細(xì)胞因子，提示hAHS可能具有調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)與炎癥過(guò)程、減輕RPMVECs損傷并降低其通透性以及殺傷病原微生物的作用。

綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：①hAHS含有促進(jìn)組織修復(fù)、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)強(qiáng)度、降低血管通透性及殺傷致病微生物的多種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子；②hAHS可減少LPS致傷后RPMVECs分泌炎癥因子TNF-α、IL-8和IL-6分泌，并促進(jìn)LPS致傷后RPMVECs增殖。因此，理論上人羊膜干細(xì)胞與MSCs一樣具有治療LPS致ALI的潛在作用，但其確切療效及其作用機(jī)制還需通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

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Effect of supernatant of human amnion homogenate on lipopolysaccharide induced pulmonary microvascular endothelial cells injury and their proliferation and expression of proinflammatory factors in rats

Chen Yunpeng*, Wang Lei, Tong Yalin, Liu Liang, Lü Lu, Mo Yongliang,Zhan Qiu, Yang Qiqiong, Liang Jing,Zhu Fujun,Gong Zhenyu, Xin Haiming.*

Base of Postgraduate Education of Guangxi Normal University; Department of Burn & Plastic Surgery,the 181st Hospital of PLA,Guilin 541002, Guangxi, China

Tong Yalin(E-mail: 1526680889@qq.com)

Objective:To investigate the protective effect of supernatant of human amnion homogenate (hAHS) on proliferation and expression of proinflammatory mediators by lipopolysaccharide (LPS) induced injured pulmonary microvascular endothelial cells of rats (RPMVECs).Methods：hAHS was prepared from fresh human amnion. The total protein content and the content of epithelial growth factor (EGF)，basic fibroblast growth factor (bFGF)，vascular endothelial growth factor (VEGF)， interleukin-4 (IL-4)， IL-10， angiogenin-1 (Ang-1)，human β-defensin2 (HBD2) of hAHS were determined with Coomassie blue staining and ELISA. The effect of 0, 10%, 15%, 20%, 25% hAHS on cell proliferation activity of RPMVECs was respectively determined with MTT assay，in order to determine the optimal concentration of hAHS on promoting RPMVECs proliferation. According to different co-culture conditions, RPMVECs were randomly divided into 4 groups：group N (cultured with 10%FBS+DMEM/F12)，group A(10%FBS+DMEM/F12+15%hAHS)，group B (10%FBS+DMEM/F12+LPS),and group C (10%FBS+DMEM/F12+15%hAHS+LPS). At 0， 12， 24， 48，72 hours after culturing with the corresponding medium of each group，optical density values (Avalues) of each group were determined respectively with MTT assay to determine the proliferation activity， and the contents of IL-6，IL-8，TNF-α levels in the culture supernates were also determined by ELISA at 6， 8， 10， 12 and 24 hours. Results: The total protein concentration of hAHS was (725.125±12.625) mg/L, and levels of EGF, bFGF, VEGF, IL-4, IL-10, Ang-1, HDB2 were respectively(504.785±4.665)ng/L,(4.426±0.138)ng/L,(0.185±0.006)ng/L，(25.650±4.104)ng/L,(13.733±2.197)ng/L,(15.561±0.496)ng/L,(4.763±0.714)ng/L.10%-20% hAHS was shown to promote proliferation of RPMVECs, and 15% hAHS, and the best result was observed on 7 and 9 days. The proliferation rate of RPMVECs in 25% hAHS group at 7, 9 and 11 days was lower than those in the 0%hAHS group (P<0.05).The proliferation activity (Avalue ) of group A was greater than that of group N at 48 and 72 hours, and it was lower in group B significantly as compared with that of group N at 24,48 and 72 hours (P<0.05), while it was significantly higher in group C compared with that of the group B at 24, 48 and 72 hours (P<0.05). ELISA result showed that the contents of IL-6 and TNF-α in group B were higher than those of group N(P<0.05). IL-8 levels of group B at 8, 10, 12 and 24 hours were higher than those of group N (P<0.05). In group C, the level of IL-6 was significantly lower than that of group B at 10 and 12 hours, IL-8 level at 8, 10, 12 and 24 hours (P<0.05), and TNF-α content at each time point (P<0.05).Conclusion: hAHS are rich in factors which can promote tissues repair, regulate immune response, reduce vascular permibility, promote hAHS on LPS induced injury of the proliferation of RPMVECs after being injured by LPS, and reduce the secretion of inflammatory cytokines after injury by LPS challenge.

Supernatant of human amnion homogenate Rat Pulmonary microvascular endothelial cells Lipopolisaccharide Cell proliferation Acute lung injury

10.3969/j.issn.1672-8521.2015.01.004

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(81301634)；廣西科學(xué)研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(1140003A-39)；廣西自然科學(xué)基金(2011GXNSFB018107，2013GXNSFBA019203)；廣西衛(wèi)生廳自籌經(jīng)費(fèi)科研課題(Z2014532)

童亞林，主任醫(yī)師(E-mail:1526680889@qq.com)

2015-01-16)

作者貢獻(xiàn)：本研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)實(shí)施、數(shù)據(jù)處理及論文撰寫(xiě)為陳云鵬和王磊共同完成，為共同第一作者。