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        市販雞肉中一株腸出血性大腸桿菌O157:H7的分離

        2015-04-18 10:41:34謝建華葉潔瑩
        中國(guó)獸醫(yī)雜志 2015年12期
        關(guān)鍵詞:磁珠屠宰場(chǎng)出血性

        藺 露,姚 璐,孫 燕,謝建華,葉潔瑩,張 雪,盧 露

        (1.重慶市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,重慶渝北401120;2.西南大學(xué),重慶北碚400715)

        市販雞肉中一株腸出血性大腸桿菌O157:H7的分離

        藺 露1,姚 璐1,孫 燕1,謝建華1,葉潔瑩1,張 雪2,盧 露2

        (1.重慶市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,重慶渝北401120;2.西南大學(xué),重慶北碚400715)

        大腸桿菌O157:H7是一種腸道出血性大腸桿菌(EHEC),屬于腸桿菌科埃希菌屬,該型具有很強(qiáng)的耐酸和耐低溫能力,可產(chǎn)生大量的Vero毒素引起人和動(dòng)物出現(xiàn)腸出血性腹瀉,兒童與老人易感染出現(xiàn)此癥;嚴(yán)重時(shí)并發(fā)腎衰竭,病死率高,具有莢膜、鞭毛和菌毛;其最適生長(zhǎng)溫度為30℃~42℃,且廣泛分布于自然界,人與人之間或人與家畜之間通過(guò)糞污染物經(jīng)口途徑傳播。繼1982年美國(guó)首次發(fā)生EHEC引起人的食物中毒事件以后,腸出血性大腸桿菌造成的食源性或水源性污染問(wèn)題正日益嚴(yán)重[1]。

        為了解重慶、云南、陜西三省市的屠宰場(chǎng)、超市和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)環(huán)境和畜禽肉產(chǎn)品中大腸桿菌O157:H7的污染情況,我們對(duì)3個(gè)省市12個(gè)屠宰場(chǎng)、7個(gè)超市和13個(gè)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的769份樣品進(jìn)行了大腸桿菌O157:H7的分離與鑒定,獲得了1株大腸桿菌O157:H7菌株,命名為WL05D01。

        1 材料與方法

        1.1 樣品采集2014年我們從重慶市的合川、江津、萬(wàn)州、黔江、長(zhǎng)壽、武隆以及陜西省的西安和云南省昆明采集樣本共769份,其中來(lái)自屠宰場(chǎng)、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、超市的豬肉樣品有173份、雞肉樣品184份、環(huán)境拭子樣品412份,見表1。

        表1 大腸桿菌O157:H7樣品采集與分布

        1.2 儀器與試劑生物學(xué)顯微鏡;梯度PCR儀;Ⅱ級(jí)生物安全柜等。Dynabeads anti-E.Coli O157(IMPs)和OXOID藥敏紙片,購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;大腸桿菌O157顯色培養(yǎng)基,購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司和博賽生物技術(shù)股份有限公司;API-20E,購(gòu)自法國(guó)生物梅里埃;大腸埃希菌診斷血清,購(gòu)自寧波天潤(rùn)生物藥業(yè)有限公司;大腸桿菌O157:H7標(biāo)準(zhǔn)菌株EK274,西北農(nóng)林大學(xué)楊保偉贈(zèng)。

        1.3 大腸桿菌的前期增菌取樣品至BPW均質(zhì)袋,37℃搖床培養(yǎng)4~6 h后;取1 mL培養(yǎng)液加入EC肉湯,37℃培養(yǎng)24 h。

        1.4 免疫磁珠與分純按大腸桿菌O157免疫磁珠試劑盒說(shuō)明書操作,取經(jīng)免疫磁珠吸附的菌液在廣東環(huán)凱大腸桿菌O157顯色培養(yǎng)基上劃線,37℃培養(yǎng)24 h;挑取可疑菌落劃線于博賽科瑪嘉O157顯色培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)24 h。

        1.5 生化鑒定按梅里埃API-20E試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行可疑菌株的生化試驗(yàn)。

        1.6 血清型鑒定O抗原分型,利用玻片凝集試驗(yàn)進(jìn)行;H抗原分型,利用試管凝集試驗(yàn)進(jìn)行。

        1.7 多重PCR鑒定按照大連寶生物TaKaRa Ex Taq?試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。多重PCR引物參照美國(guó)FDA提供的大腸桿菌O157:H7診斷引物,其中包括目的基因:stx1、stx2、+93uid A、γ-eae A、ehx A,共5段,詳見表2;PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性15 min,95℃變性1 min,56℃退火1 min,72℃延伸1 min,25個(gè)循環(huán),最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠上110 V電泳30min后觀察多重PCR結(jié)果。

        表2 大腸桿菌O157:H7多重PCR引物

        1.8 藥敏紙片試驗(yàn)將菌株接種至MH液體培養(yǎng)基中,37℃搖床培養(yǎng)24 h。將菌液比濁為0.5麥?zhǔn)蠁挝?,然后?00μL菌液于MH固體培養(yǎng)基上,用涂布棒涂布均勻后,貼上藥敏紙片,37℃培養(yǎng)24 h,觀察細(xì)菌對(duì)藥敏紙片的敏感程度,重復(fù)試驗(yàn)3次,判定參照美國(guó)NCCLS標(biāo)準(zhǔn)。

        2 結(jié)果

        2.1 細(xì)菌培養(yǎng)特性經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)室初篩,我們從來(lái)自重慶市武隆縣某農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的雞肉樣品中,分離出1株可疑的O157菌株,命名為WL05D01。WL05D01在廣州環(huán)凱大腸桿菌O157顯色培養(yǎng)基上生長(zhǎng)呈紫紅色,菌落扁平透明,邊緣光滑;在博賽科瑪嘉O157顯色培養(yǎng)基上呈淺紅色至淺紫色,中心灰褐色的菌落,經(jīng)革蘭染色,鏡檢呈革蘭陰性,兩端鈍圓,短小桿菌,大小約為0.5×1~3μm。

        2.2 生化試驗(yàn)及血清型鑒定WL05D01能發(fā)酵葡萄糖、鼠李糖、密二糖、山梨醇和甘露醇;吲哚試驗(yàn)陽(yáng)性;V-P試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)陰性;不產(chǎn)生硫化氫(H2S);O157抗原玻片凝集試驗(yàn)呈陽(yáng)性;H7抗原試管凝集試驗(yàn)呈陽(yáng)性。API-20E試劑條結(jié)果為典型大腸埃希菌。

        2.3 多重PCR樣品WL05D01與陽(yáng)性對(duì)照(標(biāo)準(zhǔn)菌株EK274)在584 bp、397 bp、348 bp、252 bp、166 bp處均出現(xiàn)了核酸條帶;與stx1、stx2、93ui?d A、eae A、ehx A基因片段大小吻合,見圖1。

        圖1 WL05D 01革蘭染色鏡檢(10×100倍)

        圖2 WL05D01多重PCR電泳圖譜

        2.4 藥敏紙片試驗(yàn)結(jié)果按照美國(guó)NCCLS標(biāo)準(zhǔn)選擇了A組(氨芐西林、頭孢噻吩、慶大霉素)、B組(阿米卡星、環(huán)丙沙星、青霉素、頭孢噻肟、頭孢哌酮)和C組(氯霉素、四環(huán)素)中共10種抗生素進(jìn)行藥敏紙片試驗(yàn),WL05D01僅對(duì)B組的青霉素出現(xiàn)了耐受。除此之外,WL05D01對(duì)苯唑西林、多粘菌素B、紅霉素也出現(xiàn)了耐受。

        3 討論

        大腸桿菌O157實(shí)驗(yàn)室分離鑒定耗時(shí)長(zhǎng),目前采用免疫磁珠(IMPs)與膠體金免疫層析法(ICA)能提高大腸桿菌O157的捕獲率[2],此次我們選用大腸桿菌O157:H7顯色培養(yǎng)基代替?zhèn)鹘y(tǒng)SMAC平皿,以及免疫磁珠(IMPs)對(duì)大腸桿菌O157進(jìn)行濃縮捕獲,從市販雞肉中分離出了1株大腸桿菌O157:H7,檢出率僅為0.54%,如果能結(jié)合膠體金免疫層析法(ICA)或許檢出率會(huì)有所提高。

        由于大腸桿菌的血清型較多,其中作為食源性能感染人的大腸桿菌O157型的菌株一般都有志賀菌素,但有可能不全[3],志賀菌素是致使感染患者出現(xiàn)出血性結(jié)腸炎和溶血性尿毒綜合征的主要致病因子[4]。丁紅雷等[5]2006年調(diào)查結(jié)果稱,重慶市和三峽庫(kù)區(qū)從豬糞便樣品中分離的大腸桿菌O157部分菌株有stx1,所有菌株均缺失stx2;上海趙秋華等[6]從豬場(chǎng)分離的菌株也僅檢出出志賀菌素stx1;此次從農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)雞肉樣品中分離的菌株WL05D01里stx1和stx2毒力基因都存在,說(shuō)明從雞肉中分離的WL05D01有可能是大腸桿菌O157高致病菌株。

        根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果,此次分離的WL05D01菌株按NCCLS標(biāo)準(zhǔn),僅對(duì)B組有選擇性報(bào)告的藥物中β-內(nèi)酰胺類的青霉素耐受;另外對(duì)3種抗生素耐受,其中涉及到大環(huán)內(nèi)酯類(紅霉素)的耐受,這也與柳巨雄等[7-8]研究結(jié)果相同。此次調(diào)查樣品采集的范圍涉及3個(gè)省市生豬屠宰場(chǎng)和零售市場(chǎng),從分離結(jié)果來(lái)看生豬屠宰場(chǎng)未檢出大腸桿菌O157型,從生豬屠宰場(chǎng)、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、超市采集的各個(gè)環(huán)節(jié)的環(huán)境拭子也未能分離出大腸桿菌O157型,但從市販雞肉分離出了大腸桿菌O157:H7,證明市販雞肉潛在著被大腸桿菌O157:H7污染的風(fēng)險(xiǎn),為避免受污染的肉品通過(guò)食物鏈進(jìn)入市場(chǎng)造成食源性疾病的暴發(fā),有關(guān)部門應(yīng)規(guī)范家禽宰殺點(diǎn)屠宰檢疫。

        [1]Riley,LeeW,Remis,etal.Hemorrhagic Colitis Associated with a Rare Escherichia coli Serotype[J].New England Journal ofMedicine,1983,12(308):681-685.

        [2]Hui Qi,Zhen Zhong,Han-Xin Zhou,et al.A rapid and highly sensitive protocol for the detection of Escherichia coli O157:H7 based on immunochromatography assay combined with the enrich?ment technique of immunomagnetic nanoparticles[J].International Journalof Nanomedicine,2011,6:3033-3039.

        [3]A tsushi Iguchi,Hiroki Shirai,Kazuko Seto,et al.W ide Distribu?tion of O157-Antigen Biosynthesis Gene Clusters in Escherichia coli[J].PLoSOne,2011:6(8):e23250.

        [4]Krystle L,Mohawk,Alison D.O'Brien.Mouse Models ofEsche?richia coliO157:H7 Infection and Shiga Toxin Injection[J].J Biomed Biotechnol,2011,2011:258185.

        [5]丁紅雷.重慶市及三峽庫(kù)區(qū)大腸桿菌O157的流行病學(xué)調(diào)查[D].重慶:西南大學(xué),2006.

        [6]趙秋華,王少輝,劉萍萍,等.上海市閔行區(qū)豬場(chǎng)中大腸桿菌O157:H7的分離鑒定及生物學(xué)特性研究[J].中國(guó)動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào),2013,2l(3):38.44.

        [7]Khana,Das SC,Ramamurthy T,etal.Antibiotic resistance viru?lence gene and molecular profiles of Shiga toxin-producing Esch?erichia coli isolates from diverse sources in calcutta,india[J].J Clin Microbiol,2002,40(6):2009-2015.

        [8]柳巨雄.動(dòng)物源性大腸桿菌O157對(duì)β-內(nèi)酰胺類和氨基糖苷類藥物耐藥相關(guān)機(jī)制的研究[D].吉林:吉林大學(xué),2005.

        S852.61+2

        B

        0529-6005(2015)12-0052-03

        2015-08-03

        農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管(風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估)項(xiàng)目(GJFP201500803)

        藺露(1983-),女,獸醫(yī)師,碩士,主要從事動(dòng)物疫病防控、實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌學(xué)檢測(cè),E-mail:yokokiki@foxmail.com

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