喬彩霞，尹 羿，蒲 靜，高志強，汪 琳，任 彤，張 偉，張利峰，張鶴曉

偽狂犬病病毒核酸檢測能力驗證樣品制備及其應用

喬彩霞，尹 羿，蒲 靜，高志強，汪 琳，任 彤，張 偉，張利峰，張鶴曉

（北京出入境檢驗檢疫局，北京朝陽100026）

能力驗證樣品的制備是實驗室病原核酸檢測能力驗證的難點和核心內(nèi)容，本研究以偽狂犬病病毒南陽株細胞培養(yǎng)物為材料，通過高溫處理的方式滅活病毒，研制了偽狂犬病病毒核酸檢測的能力驗證樣品，經(jīng)均勻性和穩(wěn)定性檢驗證實樣品達到中國合格評定國家認可委員會對能力驗證樣品的要求。利用能力驗證樣品，設計和實施了“BIQTC-2013-01《豬偽狂犬病病毒核酸檢測》能力驗證計劃”，共有7家實驗室參試，驗證滿意率達100%。偽狂犬病病毒核酸檢測能力驗證樣品的研制和在能力驗證計劃中的應用，為評估我國各級實驗室偽狂犬病病毒核酸檢測的能力提供了較有價值的借鑒和參考。

偽狂犬病病毒；核酸檢測；能力驗證

偽狂犬病病毒（Pseudorabies Virus，PrV）屬于皰疹病毒科（Herpesviridae）α-皰疹病毒亞科水痘病毒屬的豬皰疹病毒I型，能引起豬、牛、羊、犬等多種家畜和野生動物發(fā)病，其中對養(yǎng)豬業(yè)危害最大。豬感染后主要表現(xiàn)為母豬的繁殖障礙和仔豬的高病死率，病死豬是PRV的貯存宿主和傳染源。偽狂犬病呈全球性分布，通過實施根除計劃，美國、荷蘭等國家已經(jīng)撲滅了該病。但在我國和世界許多國家，本病仍頻繁發(fā)生，不僅給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，而且直接影響生豬及其產(chǎn)品的國際貿(mào)易，成為制約養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要因素［1-2］。

核酸檢測技術(shù)因具有快速、靈敏、特異性強等優(yōu)點，在偽狂犬病病毒的病原學檢測和臨床診斷中得到了廣泛的應用。國內(nèi)外學者研制了多種偽狂犬病病毒核酸檢測技術(shù)，其中應用最多的是普通PCR和熒光PCR技術(shù)［3-4］。這些檢測技術(shù)的商品化試劑盒也呈現(xiàn)出復雜多樣的趨勢，加之我國各級獸醫(yī)實驗室條件、技術(shù)水平差異較大，對偽狂犬病毒核酸檢測等能力差異較大。同時，對于病病毒的核酸擴增檢測技術(shù)，包括了樣品制備、核酸提取、PCR和結(jié)果分析等眾多環(huán)節(jié)，每一環(huán)節(jié)的不當均會直接影響到檢測結(jié)果的準確性和可靠性。正確、可靠的核酸檢測結(jié)果有賴于使用統(tǒng)一的質(zhì)控樣品對檢測方法和試劑進行嚴格的質(zhì)量控制。因此一種理想的病毒核酸質(zhì)控樣品也是試劑溯源、測量程序評價和不同實驗室間檢測結(jié)果比較的基本條件。

為了合理評估各級實驗室偽狂犬病病毒核酸檢測的技術(shù)水平和能力，我們在研制偽狂犬病病毒核酸檢測能力驗證樣品的基礎上，設計和實施了“BIQTC-2013-01《豬偽狂犬病病毒核酸檢測》能力驗證計劃”，為今后偽狂犬病核酸檢測能力的評估驗證提供了有價值的參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 毒株和細胞偽狂犬病病毒南陽株（Namy?angjuGQ325658.1）和PK15細胞由本實驗室保存。1.2主要試劑MEM細胞培養(yǎng)、胎牛血清，購自Gibco公司；DNAZol、Taq DNA酶、dNTP等PCR擴增試劑，購自Promega公司。

1.3 主要檢測方法及引物、探針應用的檢測方法有偽狂犬病病毒熒光PCR，由本實驗室建立［4］，普通PCR，參照國家標準《偽狂犬病診斷方法》（GB/T 18641-2002）操作。引物、探針詳細序列信息見表1。

表1 能力驗證樣品制備所用檢測方法及引物和探針

1.4 能力驗證樣品的制備

1.4.1 陽性質(zhì)控樣品將已長成單層的PK15細胞棄去生長液，按1%（V/V）接種PRV南陽株毒種，37℃吸附1 h，加入含2%牛血清的MEM細胞培養(yǎng)液，置37℃下培養(yǎng)觀察3～5 d，當75%～95%細胞出現(xiàn)病變時收獲，置-70℃下凍融3次，1 000 r/min離心10min，取上清液置于56℃水浴箱加熱滅活30 min，-70℃保存?zhèn)溆?。病毒培養(yǎng)液的滅活檢驗，選用PK15細胞，接種上述樣品，觀察3～5 d，應無細胞病變出現(xiàn)。樣品的稀釋，用PBS（0.01mol/L，pH值7.2）將PRV病毒培養(yǎng)液做10倍系列稀釋，采用熒光PCR和普通PCR分別檢測，選取熒光PCR的Ct值在18～22之間，普通PCR出現(xiàn)特異性擴增條帶的稀釋倍數(shù)，作為最終稀釋倍數(shù)，將培養(yǎng)液充分稀釋混勻后，每管分裝500μL，作為PRV核酸檢測能力驗證的陽性樣品。1.4.2陰性質(zhì)控樣品不含PRV的PBS（0.01mol/ L，pH值7.2）溶液，每管分裝500μL，作為PRV核酸檢測能力驗證的陰性樣品。

1.5 能力驗證樣品的分析

1.5.1 均勻性檢驗為保證驗證樣品的均勻分布，隨機從-20℃保存的能力驗證樣品中各抽取10支，編號后提取DNA，采用偽狂犬病病毒熒光PCR方法進行檢測，該檢測為一次操作，一次上機完成。對檢測獲得的Ct值，采用單因子方差分析進行統(tǒng)計，分析其變異系數(shù)。

1.5.2 穩(wěn)定性檢驗作為能力驗證樣品需通過快遞方式向參試實驗室發(fā)放樣品，為了確保樣品的穩(wěn)定性，我們模擬了樣品的實際運輸保存條件，測試其穩(wěn)定性。隨機抽取制備好的能力驗證陽性樣品，在以下3種條件下各放置10支：室溫（20℃～25℃），相對濕度20%～50%，14 d取出進行測試；冰箱冷藏（溫度2℃～8℃），14 d取出進行測試；對照（-20℃），長期放置保存。應用PRV熒光PCR檢測，對獲得的Ct值采用兩樣本均數(shù)顯著性檢驗-t檢驗進行統(tǒng)計，分析樣品的穩(wěn)定性。

1.6 能力驗證的實施

1.6.1 組織形式本次能力驗證為自愿參與，北京出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心作為CNAS認可的能力驗證提供者，統(tǒng)一提供上述制備的PRV能力驗證陽性和陰性樣品，每個實驗室隨機發(fā)放6個樣品（至少含1個陰性樣品），不指定方法，也不提供試劑盒；參試實驗室根據(jù)實際情況選擇不同方法和檢測試劑，以客觀反映實驗室偽狂犬病病毒核酸檢測的真實狀態(tài)，檢測完畢結(jié)果報驗證單位審核評價。

1.6.2 參試實驗室及參試方法本次能力驗證計劃為自愿參加，共有分別來自上海、廣東和吉林3個省的7家來自動物疫病預防控制機構(gòu)和出入境檢驗檢疫技術(shù)中心的實驗室參加了能力驗證。所有參試實驗室均報送了有效結(jié)果。參試檢測方法有2種：方法1，偽狂犬病病毒普通PCR檢測技術(shù)；方法2，偽狂犬病病毒實時熒光PCR檢測技術(shù)。

1.6.3 能力驗證結(jié)果評價本次能力驗證計劃是對豬偽狂犬病病毒核酸檢測的定性判定，以實施機構(gòu)報送的測試結(jié)果為依據(jù)，對驗證結(jié)果給予評價，如全部樣品檢測結(jié)果與樣品背景相符判定為滿意，如有不相符（假陰性或假陽性）的樣品，則判為不滿。熒光PCR的Ct值僅作為參考，不予評價。

2 結(jié)果

2.1 能力驗證樣品的制備將PRV南陽株接種PK15細胞，48 h后細胞出現(xiàn)明顯細胞病變，細胞腫脹變圓，開始呈散在的灶狀，并逐漸擴展，細胞不斷圓縮脫落，同時有大量多核巨細胞形成。收取PRV細胞培養(yǎng)物經(jīng)56℃水浴箱滅活30min后，再次接種PK15細胞未出現(xiàn)細胞病變，表明病毒已滅活完全，無生物傳染性，可用于制備能力驗證陽性樣品。

將滅活的PRV培養(yǎng)液用PBS做10倍系列稀釋，采用熒光PCR和普通PCR檢測，結(jié)果熒光PCR最低可檢測108稀釋的PRV病毒培養(yǎng)液，而普通PCR最低能檢測到105稀釋的PRV培養(yǎng)液。在保證樣品經(jīng)熒光PCR和普通PCR檢測均為陽性的條件下，我們將PRV細胞培養(yǎng)液做105倍稀釋，混勻后分裝作為能力驗證陽性樣品。見圖1、2。

圖1 熒光PCR對10倍梯度稀釋PRV病毒培養(yǎng)液進行檢測

2.2 均勻性檢測隨機抽取制備好的能力驗證陽性和陰性樣品各10管，提取DNA，用偽狂犬病病毒熒光PCR進行檢測，對獲得的Ct值進行統(tǒng)計學分析，結(jié)果陽性樣品各管間變異系數(shù)為1.70%（見表2），小于5%，表明樣品間差異不顯著，樣品均勻性良好。陰性樣品經(jīng)檢測無特異性擴增曲線，均為陰性。

圖2 普通PCR對10倍梯度稀釋PRV細胞培養(yǎng)物進行檢測M：DL-2 000DNAMarker；N：Negtive control；1～6：101～106diluted PRV

表2 能力驗證陽性樣品均勻性檢驗

2.3 穩(wěn)定性檢測將制備的能力驗證陽性樣品分別在室溫、2℃～8℃和-20℃（對照）保存一定時間，之后提取DNA進行熒光PCR檢測。檢測組與對照組（-20℃）數(shù)據(jù)作t檢驗分析，結(jié)果檢測組與對照組差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.5），表明樣品20℃～25℃和2℃～8℃保存14 d，穩(wěn)定性很好，可以滿足能力驗證樣品傳遞的要求，見表3。

表3 能力驗證樣品在不同保存條件下的穩(wěn)定性研究

2.4 能力驗證結(jié)果本次能力驗證共有7家實驗室參試，其中有2家實驗室選擇了普通PCR檢測方法，5家實驗室選擇了實時熒光PCR檢測方法。7家實驗室的檢測結(jié)果均與預期結(jié)果一致，結(jié)果滿意，見表4。

表4 能力驗證結(jié)果評價匯總

3 討論

實驗室能力驗證是實驗室管理部門、實驗室用戶和認可機構(gòu)判定實驗室檢測能力的重要手段，也是實驗室質(zhì)量控制的必要組成部分。北京出入境檢驗檢疫局是CNAS認可的能力驗證計劃提供者（CNASPT0012），根據(jù)實際需要，我們組織實施了此次《豬偽狂犬病病毒核酸檢測》能力驗證計劃。

普通PCR和熒光PCR技術(shù)是應用于偽狂犬病病毒核酸檢測的主要方法，也是本次能力驗證考核的技術(shù)指標。我們利用滅活的偽狂犬病病毒細胞培養(yǎng)物制備了能力驗證陽性樣品，并對滅活效果進行了評價，經(jīng)檢測病毒完全滅活，確保了能力驗證實施過程的生物安全。此外，在能力驗證樣品的制備上，我們兼顧兩種不同方法的敏感性，選擇了合適濃度的病毒作為陽性樣品。均勻性和穩(wěn)定性試驗表明，制備的能力驗證樣品，達到了中國合格評定委員會對能力驗證樣品的要求［5］。

本次能力驗證計劃為自愿參加，共有7家實驗室參試，均獲得了滿意的結(jié)果，預示我國現(xiàn)有的動物防疫機構(gòu)和出入境檢驗檢疫技術(shù)中心均具備開展偽狂犬病疫情監(jiān)測和診斷的能力。鑒于熒光PCR方法比與普通PCR方法更加簡便、快速和靈敏，參試實驗室中有5家選擇了熒光PCR方法，僅有2家選擇了普通PCR方法，這也表明隨著實驗室條件的改進，自動化、高靈敏的熒光PCR成為PRV核酸檢測技術(shù)的首選。但鑒于當前用于偽狂犬病病毒檢測的普通PCR方法已經(jīng)有相應的國家標準，但熒光PCR方法還缺泛相應的標準，建議及時制定相應標準以指導該方法在臨床檢測中的標準化和規(guī)范化使用。

［1］甘孟侯，楊漢春.中國豬病學［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2005：117-182.

［2］鄧仕偉，汪勇，薛春芳.我國偽狂犬病流行現(xiàn)狀及新特點［J］.動物醫(yī)學進展，2006，27（9）：105-107.

［3］OIE.TerrestrialManualChapter 2.1.2-Aujeszky′s disease［EB/OL］2.0http：//www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/ 2012，2.01.02_AUJESZKYS_DIS.pdf.

［4］朱淑芬，朱瑞良，喬彩霞，等.檢測偽狂犬病毒gB基因熒光定量PCR方法的建立［J］.中國獸醫(yī)學報，2012，32（10）：1413-1417.

［5］中國合格評定國家認可委員會.能力驗證樣品均勻性和穩(wěn)定性評價指南［EB/OL］.http://www.cnas.org.cn/fwzl/nlyzzl/nlyzxgzcyzl/ images/2012/11/30/4531B182D5936810C8AD6519B4F6897E.pdf CNAS—GL03:1-7，2006-6.

Development and application evaluation of sam ples for proficiency testing for Pseudorabies Virus nucleic acid detection

QIAOCai-xia，YIN Yi，PU Jing，GAO Zhi-qiang，WANG Lin，REN Tong，ZHANGWei，ZHANG Li-feng，ZHANG He-xiao
（Beijing Enrty-exit Inspection and Quarantine Bureau，Beijing 100026，China）

Appraisal sample preparation was the focal point and core of the Proficiency Testing（PT）program for pathogen nu?cleic acid assay.In this study，we used cell cultures of pseudorabies virus Nanyang strain as originalmaterials，and prepared the test samples of nucleic acid assay for pseudorabies virus by dry heat inactivated viruses.Based on the results of uniformityand sta?bility test，the samplesmet the needs of China national accreditation service for conformity assessment，and could be used for Profi?ciency Testing（PT）program of nucleic acid assay of pseudorabies（BIQTC-2013-01）.A total of seven labs participated in the PT program and feedback the results，and the satisfactory ratewas 100%.In summary，we developed test samples and used them in the appraisal program of nucleic acid assay for pseudorabies virus，which lays the foundations for the certification and accreditation of laboratory testingmethods.

pseudrabiesvirus；nucleic acid test；proficiency testing

ZHENGHe-xiao

S852.659

A

0529-6005（2015）12-0006-04

2015-06-11

質(zhì)檢公益性行業(yè)科研專項《動物疫病核酸標準物質(zhì)制備關(guān)鍵技術(shù)研究》（201310253）

喬彩霞（1978-），女，高級獸醫(yī)師，博士，主要從事動物疫病檢測技術(shù)研究，E-mail：qiaocx@bjciq.gov.cn

張鶴曉，E-mail：aqlzhx@126.com