張向前，董新龍，李虹，凌姣姣，張跟喜，王金玉（揚州大學動物科學與技術學院，江蘇省動物遺傳繁育與分子設計重點實驗室，江蘇揚州 225009）

不同雞品種IGF-I基因5′調控區(qū)TrulⅠ位點的多態(tài)性分析

張向前，董新龍，李虹，凌姣姣，張跟喜*，王金玉
（揚州大學動物科學與技術學院，江蘇省動物遺傳繁育與分子設計重點實驗室，江蘇揚州 225009）

胰島素樣生長因子-I是調節(jié)動物生命活動重要的多肽生長因子之一，它對動物的生長發(fā)育及代謝有重要的調控作用。本研究根據(jù)GenBank中發(fā)表的雞胰島素樣生長因子I基因（IGF-I）的序列針對5′調控區(qū)的TrulⅠ位點設計1對引物。采用PCR-RFLP技術檢測邊雞、京海黃雞、尤溪麻雞和AA雞TrulⅠ位點的多態(tài)性，并試圖探索Trul I位點的多態(tài)性和邊雞經濟性狀的關系。結果表明：邊雞、京海黃雞和尤溪麻雞TrulⅠ位點存在多態(tài)性，而AA雞不存在多態(tài)性；在京海黃雞和尤溪麻雞中形成AA、AB和BB 3種基因型，在邊雞中僅存在AA和AB基因型，基因型分布在4個雞品種中并不一致。該位點能否作為邊雞經濟性狀的一個遺傳標記有待進一步研究。

胰島素樣生長因子I基因；雞；PCR-RFLP；多態(tài)性

胰島素樣生長因子-1是調節(jié)動物生命活動重要的多肽生長因子之一，它對動物的生長發(fā)育及代謝有重要的調控作用。雞IGF-I基因全長約50 kb，包括4個外顯子和3個內含子［1］。近年來隨著IGFI基因在家禽中的研究不斷深入，已確定IGF-1基因在禽類胚胎期和出生后的生長過程中起重要作用［2］。Gouda等［3］研究了IGF-I基因的多態(tài)性對埃及雞品種生長性狀的影響。Promwatee等［4］研究了IGF-I基因的多態(tài)性與4個泰國雞品種生長和屠宰性能的相關性，發(fā)現(xiàn)IGF-I對4個雞品種的初生重，4、8、12、14周齡重以及0～14周齡的日增重均有顯著影響。萬秋蓓等［5］進行了IGF-I基因5′調控區(qū)Pst I位點的多態(tài)性與繁殖性狀關系的研究，發(fā)現(xiàn)新?lián)P州雞中，BB型在產蛋性能上表現(xiàn)出了強烈的優(yōu)勢。研究已證明，IGF-I基因多態(tài)性與雞的生長性狀、繁殖性狀以及屠宰性狀存在關系。

關于雞IGF-I基因的5′調控區(qū)國內外學者做了很多研究。Li等［6］、王寶維等［7］采用PCR-RFLP技術運用PstⅠ酶針對雞IGF-I基因5′調控區(qū)的同一位點進行了研究，測序結果表明，PstⅠ識別位點發(fā)生了C→T突變。Amills等［8］、Zhou等［9］采用PCR-RFLP技術運用HinfⅠ酶針對雞的IGF-I基因的5′調控區(qū)的另一酶切位點進行了研究，測序結果表明，HinfⅠ識別位點發(fā)生了A→C突變。王強等［10］運用PCR-SSCP技術在雞的IGF-I基因的5′非翻譯區(qū)發(fā)現(xiàn)一個G的插入。Nagaraja等［11］在IGF-I基因5′非翻譯區(qū)發(fā)現(xiàn)Pst I位點。劉大林等［12］也通過PCR-SSCP技術在京海黃雞5′非翻譯區(qū)發(fā)現(xiàn)2個A的插入。

5′調控區(qū)的很多位點都已被發(fā)現(xiàn)，并都做了深入的研究。雞IGF-I基因5′調控區(qū)Trul I位點由王慧華等［13］發(fā)現(xiàn)，目前關于Trul I位點的研究極少。本研究采用PCR-RFLP技術，以邊雞、京海黃雞、尤溪麻雞和AA雞為研究對象，研究IGF-I基因5′調控區(qū)TrulⅠ位點的多態(tài)性，并試圖以邊雞為研究對象進一步探索Trul I位點和邊雞經濟性狀的關系，為4個雞品種的保種和標記輔助選擇提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料300只七世代邊雞母雞血樣采自山西省農科院畜牧獸醫(yī)研究所；84只京海黃雞和32只AA雞血樣采自江蘇京海禽業(yè)集團有限公司；30只尤溪麻雞血樣采自中國農業(yè)科學院家禽科學研究所國家地方禽種遺傳資源基因庫。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取翅靜脈采集血樣1.5 mL，肝素鈉抗凝，置冰盒帶回實驗室，-20℃保存。常規(guī)苯酚-氯仿法抽提基因組DNA，對基因組DNA進行OD值測定，并計算其濃度后備用。

1.2.2 引物設計和PCR擴增根據(jù)GenBank中的雞IGF-Ⅰ基因序列（GenBank登錄號為EF488284）針對5′調控區(qū)TrulⅠ位點設計1對引物，擴增產物大小為157 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列：F：5′-AATATGAGCAGCACGGTTGA-3′；R：5′-TTTTCC AAACAGTGATGGTAGC-3′。PCR反應完成后，用10%的聚丙烯酰胺凝膠檢測擴增結果。

1.2.3 PCR-RFLP檢測PCR產物用TrulⅠ酶切，以檢測多態(tài)性。酶切反應總體積為20 μL，超純水16.5 μL，Bbv I酶（10 U/μL）0.5 μL，10×Buffer 2 μL，37℃酶切2 h，酶切產物用交聯(lián)度為（Acr：Bis）29∶1的非變性聚丙烯酰胺凝膠檢測，200 V電泳5 h，硝酸銀染色。

1.3 統(tǒng)計分析

1.3.1 哈代-溫伯格平衡檢驗用卡方檢驗公式，公式如下：

其中，Ei為理論值，Oi為實際觀察值，n為等位基因數(shù)。1.3.2卡方獨立性檢驗用SPSS11.0的Crosstabs程序進行。

2 結 果

2.1 PCR擴增結果PCR擴增顯示所設計的引物擴增效果好，片段長度和預期一致，沒有非特異性擴增產物，可以進行PCR-RFLP檢測（圖1）。

圖1 IGF-I基因TrulⅠ位點的PCR產物

2.2 PCR-RFLP檢測及測序結果用TrulⅠ酶消化引物的擴增產物，顯示3種基因型，分別命名為AA、AB和BB型（圖2）。當擴增產物的43 bp處為A時，TrulⅠ酶切產生121 bp和36 bp的片段；當43 bp處為G時，無TrulⅠ酶切位點。

圖2 IGF-I基因TrulⅠ位點的酶切產物圖

2.3 IGF-I基因TrulⅠ位點的基因型頻率和基因頻率分析由表1可知。在AA雞中只存在AA基因型，在邊雞中AA基因型的頻率高達0.993。在京海黃雞和尤溪麻雞中，AB基因型都為優(yōu)勢基因型，頻率分別為0.560和0.600。京海黃雞和尤溪麻雞的優(yōu)勢等位基因分別為B和A，頻率分別為0.530和0.600。卡方適合性檢驗，4個雞品種在TrulⅠ位點都處于哈代-溫伯格平衡狀態(tài)（P＞0.05）。

2.45 ′調控區(qū)基因型分布的卡方獨立性檢驗4個雞品種5′調控區(qū)TrulⅠ位點的卡方獨立性檢驗結果見表2。在4個雞品種中的基因型分布并不一致。邊雞與京海黃雞和尤溪麻雞存在極顯著差異（P＜0.01）。京海黃雞與AA雞差異極顯著（P＜0.01），而與尤溪麻雞差異不顯著（P=0.162）。尤溪麻雞與AA雞差異極顯著（P＜0.01）。

3 討論

本研究表明，邊雞、京海黃雞和尤溪麻雞IGF-I基因5′調控區(qū)TrulⅠ位點存在多態(tài)性，擴增產物43 bp處發(fā)生A到G的替換，而AA雞在該位點表現(xiàn)為單態(tài)，這與王慧華等［13］的研究結果一致。在邊雞和尤溪麻雞中A等位基因頻率分別為99.7%和60.0%，A為優(yōu)勢等位基因；在京海黃雞中B等位基因頻率為53.0%，B為優(yōu)勢等位基因。4個雞品種中的基因型分布并不一致，邊雞與京海黃雞和尤溪麻雞存在極顯著差異，京海黃雞與AA雞差異極顯著，而與尤溪麻雞差異不顯著。這可能和4個品種的經濟類型不同有關，邊雞和尤溪麻雞屬于肉蛋兼用型，京海黃雞是新培育的小型優(yōu)質肉雞，AA雞為美國肉雞品種。但邊雞、京海黃雞和尤溪麻雞都處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，可能是該位點未受選育的影響，在選育過程中它們的遺傳仍然是隨機的，或者是經過人工選育后經隨機交配該位點又到達新的平衡。

表1 4個雞品種IGF-Ⅰ基因5′調控區(qū)的基因型和等位基因頻率

表2 4個雞品種5′調控區(qū)TrulⅠ位點基因型分布的卡方獨立性檢驗

另外，從本研究的結果中發(fā)現(xiàn)，在邊雞中雖然檢測到Trul I位點的多態(tài)性，但AA基因型的頻率達到99.3%，AB基因型的頻率僅為0.7%，BB基因型的頻率為0，結果并不理想。由于邊雞處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，要想進一步研究Trul I位點和邊雞經濟性狀的關系，以及該位點能否作為邊雞經濟性狀的一個遺傳標記，必須進行人工選擇，提高B等位基因的頻率，使3種基因型的樣本數(shù)量達到要求。

4 結 論

邊雞、京海黃雞和尤溪麻雞IGF-I基因5′調控區(qū)的TrulⅠ存在多態(tài)性，而AA雞不存在多態(tài)性。由于邊雞的TrulⅠ位點多態(tài)性豐富性不足，該位點和邊雞經濟性狀的相關關系還需進一步研究。

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Polymorphsims of the TrulⅠLocus in the 5′Regulator Region of IGF-I Gene of Different Chicken Breeds

ZHANG Xiang-qian，DONG Xin-long，LI Hong，LING Jiao-jiao，ZHANG Gen-xi*，WANG Jin-yu
（College of Animal Science and Technology，Yangzhou University，Key Laboratory of Animal Genetics，Breeding，Reproduction and Molecular Design of Jiangsu Province，Jiangsu Yangzhou 225009，China）

The insulin-like growth factor I（IGF-I）is one of the important polypeptide growth factor in regulating animal life activities，it is important regulator of growth and metabolism to animals.One pair of primers were designed to amplify the 5'regulator region of IGF-I gene，based on the chicken DNA sequence of the IGF-I gene in the GenBank.PCR-RFLP was used to dectect the polymorphsims of the TrulⅠlocus in the Bian，Jinghai，Youxi and AA chickens，and try to explore the relationship between the polymorphisms of Trul I loci and economic traits of Bian chicken.The results showed that the Bian，Jinghai and Youxi chickens displayed polymorphisms，and AA chicken was monomorphic.AA，AB and BB genotypes were formed in the Jinghai and Youxi chickens.Only two genotypes（AA and BB）were detected in the Bian chicken.The genotypes distribution were not consistent in the four chicken Breeds. Whether the locus can be used as a genetic marker for economic traits in the Bian chickens needs further research.

insulin-like growth factor I；chicken；PCR-RFLP；polymorphsim

S831.2

：A

：0258-7033（2015）19-0001-03

2014-12-16；

2015-03-06

江蘇省科技支撐計劃（BE2013386）；國家自然科學基金（31201793）；國家肉雞產業(yè)技術體系（nycytx-42-G1-05）

張向前（1991-），男，河南商丘人，碩士生，研究方向為動物遺傳育種與繁殖，E-mail：627446718@qq.com

*通訊作者：張跟喜（1981-），男，江蘇溧陽人，副教授，E-mail：gxzhang@yzu.edu.cn