張 仁，張圣潔，張學研，李 彤，臧文巧

鄭州大學基礎(chǔ)醫(yī)學院微生物與免疫學教研室 鄭州 450001

CLPTM1L與miR-494靶向關(guān)系的雙熒光素酶報告實驗驗證

張 仁，張圣潔，張學研，李 彤，臧文巧#

鄭州大學基礎(chǔ)醫(yī)學院微生物與免疫學教研室 鄭州 450001

#通信作者，女，1979年8月生，博士，副教授，研究方向：食管癌病因?qū)W，E-mail: zangwenqiao@sina.com

miR-494; CLPTM1L; 雙熒光素酶報告系統(tǒng)

目的：確定miR-494與CLPTM1L的靶向關(guān)系。方法：采用生物信息學方法預測miR-494與CLPTM1L基因的結(jié)合位點。采用PCR技術(shù)擴增CLPTM1L基因3’UTR片段，并克隆至pmirGLO載體，構(gòu)建野生型及突變型重組雙熒光素酶報告質(zhì)粒。將培養(yǎng)的293T細胞分為4組，分別共轉(zhuǎn)染miR-494或陰性對照和pmirGLO-CLPTM1L-W 3’UTR或pmirGLO-CLPTM1L-M 3’UTR，檢測4組細胞中熒光素酶活性。結(jié)果：酶切和測序證實成功構(gòu)建了野生型及突變型重組雙熒光素酶報告質(zhì)粒pmirGLO-CLPTM1L-W 3’UTR和pmirGLO-CLPTM1L-M 3’UTR；與共轉(zhuǎn)染miR-494 mimics和突變型CLPTM1L 3’UTR質(zhì)粒的293T細胞中熒光素酶活性(1.056 4±0.163 4)、共轉(zhuǎn)染陰性對照序列和突變質(zhì)粒的293T細胞中熒光素酶活性(0.961 3±0.177 9)或野生型質(zhì)粒的293T細胞中熒光素酶活性(0.983 4±0.001 2)相比，共轉(zhuǎn)染miR-494 mimics和野生型CLPTM1L 3’UTR質(zhì)粒的293T細胞中熒光素酶活性(0.651 6±0.136 4)明顯降低(F=4.476，P=0.040)，其他3組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結(jié)論：CLPTM1L與miR-494存在靶向關(guān)系。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一組內(nèi)源性的、高度保守的非編碼RNA，通過與mRNA 3’非編碼區(qū)(3’UTR)結(jié)合,進行轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,從而調(diào)控靶基因的表達[1-2]，進而參與一系列生物學過程,如脂肪代謝、細胞分化、凋亡等[3-4]。作者通過生物信息學方法分析了唇腭裂跨膜1樣蛋白(cleft lip and palate transmembrane 1 like，CLPTM1L)基因與miR-494的靶向關(guān)系，并進一步應用雙熒光素酶報告實驗來驗證miR-494對CLPTM1L的靶向調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人腎上皮細胞系293T細胞株購自ATCC公司，T4 DNA 連接酶、限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和XhoⅠ、Taq DNA 聚合酶、dNTP 購自TaKaRa 公司，DH5α感受態(tài)大腸桿菌購自Solarbio公司；PCR產(chǎn)物回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、總RNA提取試劑盒購自Invitrogen公司，質(zhì)粒pmirGLO、熒光素酶檢測系統(tǒng)、DNA提取試劑盒購自Promega公司；根據(jù)CLPTM1L基因3’UTR序列(NM_030782)設(shè)計合成引物，上下游引物分別引入限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和XhoⅠ識別位點，PCR 引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成，序列見表1，由Invitrogen公司完成測序； miR-494 mimics 及陰性對照購自上海吉瑪公司。

表1 PCR引物序列

1.2 miR-494靶基因的生物信息學預測 采用TargetScan 6.0、miRBase和miRanda軟件在線搜索可能與CLPTM1L基因3’UTR作用的miRNA。

1.3 CLPTM1L基因野生型和突變型的3’UTR片段的擴增及純化 以健康人外周血DNA 為模板，以野生型CLPTM1L 3’UTR的上、下游引物進行野生型3’UTR片段擴增，以野生型CLPTM1L 3’UTR上游引物和突變型CLPTM1L 3’UTR下游引物進行突變型3’UTR片段擴增?？傮w系均為30 μL。擴增條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃ 35 s，55 ℃ 35 s，72 ℃ 40 s，共35個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72 ℃延伸3 min。取擴增產(chǎn)物，用15 g/L的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，切膠純化回收。

1.4 野生型及突變型CLPTM1L基因T載體的構(gòu)建 將PCR擴增的CLPTM1L基因野生型及突變型膠回收產(chǎn)物與pGEM-T載體連接，在T4連接酶的作用下，置于4 ℃過夜連接，轉(zhuǎn)化入Top10感受態(tài)細菌，進行重組子的篩選與鑒定。

1.5 CLPTM1L基因野生型及突變型雙熒光素酶報告載體的構(gòu)建 參照質(zhì)粒提取試劑盒說明書分別提取野生型和突變型重組pGEM-T質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和XhoⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)再次純化回收，用T4 DNA 連接酶與熒光素酶報告載體pmirGLO連接，轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)大腸桿菌，提取質(zhì)粒，XbaⅠ和XhoⅠ雙酶切初步鑒定，測序。重組質(zhì)粒分別命名為pmirGLO-CLPTM1L-W 3’UTR和pmirGLO-CLPTM1L-M 3’UTR。

1.6 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 于37 ℃、體積分數(shù)5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，用含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)293T細胞，細胞貼滿培養(yǎng)瓶瓶底約75%時可傳代培養(yǎng)。實驗用對數(shù)生長期細胞。采用胰蛋白酶消化293T細胞，PBS洗滌后，再加1.4 mL PBS調(diào)整細胞密度至2×107mL-1，分4組(A組：共轉(zhuǎn)染陰性對照序列和野生型CLPTM1L 3’UTR；B組：共轉(zhuǎn)染miR-494 mimics和野生型CLPTM1L 3’UTR；C組：共轉(zhuǎn)染陰性對照序列和突變型CLPTM1L 3’UTR；D組：共轉(zhuǎn)染miR-494 mimics和突變型CLPTM1L 3’UTR)進行電轉(zhuǎn)，每組250 μL細胞懸液中分別加入30 μL miRNA-494 mimics或陰性對照序列和相應的重組質(zhì)粒(pmirGLO-CLPTM1L-W 3’UTR/pmirGLO-CLPTM1L-M 3’UTR)6 μL，混勻后分別置于4個BTX電轉(zhuǎn)杯中(4 mm)，ECM2001電轉(zhuǎn)儀電轉(zhuǎn)，之后逐滴加入有血清的培養(yǎng)液中混勻，接種于24孔板中，每組設(shè)置3個復孔，置于37 ℃、體積分數(shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.7 各組細胞中熒光素酶活性的變化 收集轉(zhuǎn)染30 h后的293T細胞，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明，使用熒光發(fā)光檢測儀測定細胞中螢火蟲熒光素信號及海腎熒光素信號。

1.8 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0進行分析，采用單因素方差分析和LSD-t檢驗比較4組細胞中熒光素酶活性的差異，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學預測結(jié)果 見圖1。通過在線分析軟件分析，CLPTM1L基因3’UTR 465-471序列與miR-494序列間存在特定結(jié)合區(qū)域，CLPTM1L是miR-494的靶基因。

圖1 miR-494在CLPTM1L 3’UTR 上的預測結(jié)合位點

2.2 野生型及突變型CLPTM1L基因T載體的構(gòu)建結(jié)果 見圖2。PCR結(jié)果顯示，擴增野生型CLPTM1L的3’UTR 序列(446 bp)及突變型CLPTM1L 3’UTR 序列(452 bp)，與理論片段大小一致( 圖2左)。重組T載體通過XbaⅠ和XhoⅠ雙酶切初步鑒定，分別得到野生型3’UTR片段及其突變型3’UTR片段( 圖2右)，與預期相符。

圖2 野生型及突變型CLPTM1L基因T載體的構(gòu)建結(jié)果

左：PCR 擴增CLPTM1L基因3’UTR 序列(M: DNA Marker; 1: 野生型；2：突變型)；右：T載體重組質(zhì)粒XbaⅠ、XhoⅠ雙酶切(M：DNA Marker；1:野生型重組質(zhì)粒雙酶切片段；2：突變型重組質(zhì)粒雙酶切片段)。

2.3 重組野生型及突變型CLPTM1L基因pmirGLO載體的構(gòu)建結(jié)果 見圖3。將重組pmirGLO載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，隨機挑取野生型/突變型菌落進行菌液PCR鑒定，結(jié)果顯示與理論擴增的PCR片段大小一致(圖3左)。測序結(jié)果證實插入的片段與預期完全一致(圖3右)。

圖3 重組野生型及突變型CLPTM1L基因pmirGLO載體的構(gòu)建及部分測序結(jié)果

A：PCR 擴增CLPTM1L基因3’UTR 序列(M：DNA Marker；1：野生型CLPTM1L 3’UTR；2：突變型CLPTM1L 3’UTR)；右：pmirGLO-CLPTM1L-W 3’UTR和pmirGLO-CLPTM1L-M 3’UTR部分測序圖。

2.4 各組細胞中熒光素酶活性的變化 D組(1.056 4±0.163 4)、C組(0.961 3±0.177 9)或野生型質(zhì)粒(0.983 4±0.001 2)的293T細胞中熒光素酶活性相比，共轉(zhuǎn)染miR-494 mimics和野生型CLPTM1L 3’UTR的293T細胞中熒光素酶活性(0.651 6±0.136 4)明顯降低(F=4.476P=0.040)，其他3組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3 討論

在miRNA的研究中，經(jīng)常用熒光素酶報告技術(shù)來驗證目的基因是否為miRNA的靶基因。熒光素酶報告實驗的原理是以熒光素為底物來檢測螢火蟲熒光素酶活性的一種報告系統(tǒng)[5]。熒光素和熒光素酶這一生物發(fā)光體系可以極其靈敏、高效地檢測基因的表達。在以往實驗[6]中通常使用pGL3報告載體，還需加入對照載體pRL-TK，實驗時需要同時轉(zhuǎn)染2個載體，步驟較為復雜，無形中增加了成本和勞動量，而且結(jié)果不穩(wěn)定，批次內(nèi)和批次間差異較大。該實驗使用的pmirGLO報告載體[7]同時含有螢火蟲熒光素酶基因和海腎熒光素酶基因，可以在單管中進行雙熒光素酶報告基因測試，快速、靈敏、簡便，還可減少內(nèi)在因素的變化對實驗準確性的影響，如不同實驗組中細胞的數(shù)目和活力的差別、細胞轉(zhuǎn)染和裂解效率的不同等[8]。

近年來研究[9]發(fā)現(xiàn)，miRNA的異常表達與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)，其通過多種靶基因、信號通路對腫瘤發(fā)生發(fā)展進行調(diào)控。目前已證實miR-494的異常表達與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)[10]，如胃癌[11]、胃腸道間質(zhì)瘤、膽管癌、淋巴瘤[12-13]、肺癌[14-15]等。作者利用生物信息學技術(shù)預測CLPTM1L可能是miR-494的靶基因，通過構(gòu)建野生型和突變型CLPTM1L基因雙熒光素酶報告載體，經(jīng)過雙熒光素酶報告實驗證實了miR-494與CLPTM1L基因具有靶向關(guān)系，且熒光素酶報告實驗證實miR-494可以特異性作用于CLPTM1L基因的3’UTR位置的465-471序列，對其上游Luc基因表達進行負調(diào)控。這一結(jié)果為進一步研究miR-494在腫瘤中的作用提供了部分參考。

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(2014-09-02 收稿 責任編輯趙秋民)

Identification of miR-494 target gene-CLPTM1L by luciferase reporter assay

ZHANGRen,ZHANGShengjie,ZHANGXueyan,LITong,ZANGWenqiao

DepartmentofImmunologyandMicrobiology,CollegeofBasicMedicalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

miR-494;CLPTM1L;luciferase reporter assay

Aim: Analysis and identification of miR-494 potential target gene CLPTM1L. Methods: Bioinformatics analysis suggested CLPTM1L was a target of miR-494. PCR was performed to obtain wild-type and mutant CLPTM1L 3’UTR fragments, which were cloned into pmirGLO and constructed the recombinant plasmids pmirGLO-CLPTM1L-W and pmirGLO-CLPTM1L-M, respectively. 293T cells were cultured. Two recombinant plasmids were co-transfected into 293T cells with the miR-494 mimics or scrambled oligonucleotide(negative control), and the relative luciferase activity was determined by luciferase reporter assay. Results: With identification of restriction enzyme digestion and sequencing, the sequences of CLPTM1L-W 3’UTR and CLPTM1L-M 3’UTR were cloned into pmirGLO successfully．Compared with the group of miR-494 mimics co-transfected with pmirGLO-CLPTM1L-M(1.056 4±0.163 4) and the groups of miR-NC co-transfected with pmirGLO-CLPTM1L-W(0.983 4±0.001 2) or pmirGLO-CLPTM1L-M(0.961 3±0.177 9), the relative luciferase activity in group of miR-494 mimics co-transfected with pmirGLO-CLPTM1L-W showed a significant decrease(0.651 6±0.136 4；F=4.476，P=0.040). No difference was found among the aforementioned three groups(P>0.05).Conclusion: CLPTM1L is a target gene of miR-494.

10.13705/j.issn.1671-6825.2015.03.033

Q786