陳林莉，方繼德，黎莉*

1.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北 武漢 430074；2.綠色化工過(guò)程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（武漢工程大學(xué)），湖北 武漢 430074

正交試驗(yàn)優(yōu)選虎杖總黃酮的提取工藝

陳林莉1，2，方繼德1，2，黎莉1，2*

1.武漢工程大學(xué)化工與制藥學(xué)院，湖北 武漢 430074；2.綠色化工過(guò)程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（武漢工程大學(xué)），湖北 武漢 430074

為了比較虎杖總黃酮的超聲法和冷浸法的提取效果，考察了乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間對(duì)虎杖總黃酮的影響，采用正交試驗(yàn)，分別對(duì)超聲提取和冷浸提取虎杖總黃酮的工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化.運(yùn)用spss 19.0軟件，對(duì)正交試驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析.結(jié)果表明，對(duì)虎杖總黃酮提取率影響最大的為料液比，乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間對(duì)其也有一定影響.虎杖中總黃酮最佳的提取工藝為乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%，料液比1∶50，超聲提取10m in.在該條件下，總黃酮提取率為19.31%.與冷浸法比較，超聲法提取虎杖中總黃酮具有較高的提取率，對(duì)進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用虎杖中總黃酮具有一定的指導(dǎo)作用.

虎杖；總黃酮；正交試驗(yàn)；超聲法

0 引言

虎杖為蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的干燥根莖和根.我國(guó)大部分地區(qū)均產(chǎn)，主產(chǎn)于江蘇、江西、山東、四川等地［1］.虎杖具有瀉下、祛痰止咳、降壓、止血、鎮(zhèn)痛等藥理作用，它的主要成分包括虎杖苷、黃酮類、大黃素、大黃素甲醚、白藜蘆醇、多糖.據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，黃酮類化合物具有抗氧化、調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)、鎮(zhèn)痛、利膽保肝、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)等作用［2－3］.現(xiàn)代研究表明，黃酮類化合物具有良好的抗病毒作用［4－5］.本研究采用正交試驗(yàn)法，分別對(duì)超聲法和冷浸法提取虎杖總黃酮的工藝參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，同時(shí)對(duì)兩種提取方法的效果作了比較，為虎杖總黃酮的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用奠定了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；KQ－250型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DZF－6090真空干燥箱（上?，槴\實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）.虎杖購(gòu)于武漢市傳奇春天大藥房，產(chǎn)地四川，經(jīng)武漢工程大學(xué)黎莉教授鑒定為蓼科植物虎杖Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.的干燥根莖和根；蘆丁對(duì)照品（供UV法測(cè)定，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為92.6%，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100080－201409）；其余試劑均為分析純.

1.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)，選定乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、提取時(shí)間（C）為考察因素，虎杖總黃酮含量為考察指標(biāo)，按照L9（33）正交表設(shè)計(jì)，超聲提取因素水平表見(jiàn)表1，冷浸提取因素水平表見(jiàn)表2.

表1 超聲提取因素水平表Table 1 Factors and levels of ultrasonic extraction

表2 冷浸提取因素水平Table 2 Factors and levels of cold soak extraction

1.3 總黃酮含量測(cè)定

1.3.1 對(duì)照品溶液的制備精密稱取蘆丁對(duì)照品21.6 mg，加少量質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%乙醇溶解后置于100 mL容量瓶中并定容，搖勻，即得蘆丁對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度為0.2 mg·mL－1.

1.3.2 測(cè)定吸收波長(zhǎng)的確定精密量取上述蘆丁對(duì)照品溶液1mL，置于25mL容量瓶中，加蒸餾水至6mL，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%NaNO2溶液1mL，充分搖勻后靜置6min；加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%A l（NO3）3溶液1mL，搖勻，靜置6min；加質(zhì)量分?jǐn)?shù)4% NaOH溶液10mL，再加蒸餾水定容至刻度，搖勻后靜置15min，以未加蘆丁對(duì)照品試液作空白對(duì)照，于400~800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果顯示在500 nm處有最大吸收峰，故選擇500 nm為測(cè)定波長(zhǎng).

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制精密量取蘆丁對(duì)照品溶液0、1、2、3、4、5、6m L，按照“1.3.2”步驟操作，以未加蘆丁對(duì)照品的試液作空白對(duì)照，在500 nm處測(cè)吸光度，縱坐標(biāo)為吸光度A，橫坐標(biāo)為蘆丁質(zhì)量濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)擬合得線性回歸方程為：A＝12.282C－0.020 1，R2＝0.999 6.結(jié)果表明蘆丁對(duì)照品在0.008～0.048mg·mL－1質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好.

1.3.4 供試品溶液的制備準(zhǔn)確稱取干燥過(guò)孔徑0.425mm篩虎杖約1.00 g，按正交試驗(yàn)表中條件提取，提取液過(guò)濾后定容至100mL容量瓶中，即得供試品溶液.

1.3.5 樣品含量測(cè)定精密量取上述供試品溶液0.5mL，按“1.3.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，根據(jù)回歸方程可計(jì)算總黃酮含量.

1.4 方法學(xué)考察

1.4.1 精密度試驗(yàn)精密量取同一供試品溶液6份，每份0.5 mL，分別置于25 mL容量瓶中，按“1.2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度.結(jié)果，RSD＝1.456%，表明該方法有較好的精密度.

1.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)精密量取供試品溶液0.5mL，置于25 mL容量瓶中，按“1.3.3”項(xiàng)下方法每隔5 min測(cè)定一次吸光度，共測(cè)6次.結(jié)果，RSD＝1.185%，表明樣品的穩(wěn)定性良好.

1.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)平行制備6份供試品溶液，按“1.3.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度.結(jié)果，RSD＝1.857%，表明該方法重復(fù)性較好.

1.4.4 加樣回收率試驗(yàn)精密量取已知含量的供試品溶液6份，每份0.25mL，分別精密加入一定量的蘆丁對(duì)照品溶液，按“1.3.3”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度.結(jié)果，平均回收率為99.208%，RSD＝0.988%，表明該方法回收率高.

2 結(jié)果與討論

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4.

由表3和表4得出，超聲法中RB＞RA＞RC，表明影響總黃酮提取率的因素順序?yàn)榱弦罕龋疽掖假|(zhì)量分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間.可知對(duì)總黃酮提取率的影響較大的是料液比、乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)，提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響較小，但由于試驗(yàn)次數(shù)較少，均未見(jiàn)顯著性差異.因此，超聲法最佳提取工藝為A3B3C1，即乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%，料液比1∶50，提取時(shí)間10 min.

冷浸法中RB＞RA＞RC，表明影響總黃酮提取率的因素順序?yàn)榱弦罕龋疽掖假|(zhì)量分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間.可知對(duì)總黃酮提取率的影響較大的因素為乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)、料液比，提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響較小，但由于試驗(yàn)次數(shù)較少，均未見(jiàn)顯著性差異.因此，冷浸法最佳提取工藝為A3B3C2，即乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%，料液比1∶50，提取時(shí)間24 h.

由上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，超聲法和冷浸法對(duì)總黃酮提取率的影響因素相似.但超聲法提取效果優(yōu)于冷浸法，且超聲提取時(shí)間較短，故虎杖總黃酮的最佳提取工藝為：乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%、料液比為1∶50、超聲提取10min.

2.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取干燥虎杖（過(guò)孔徑0.425 mm篩）約1.00 g，按超聲法最佳提取工藝A3B3C1平行操作3次，其總黃酮平均提取率為19.31%，RSD＝1.16%.驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與正交試驗(yàn)結(jié)果基本一致，表明該提取工藝穩(wěn)定可行.

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of orthogonal experiment

表4 方差分析結(jié)果Table 4 Results of variance analysis

3 結(jié)語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)正交試驗(yàn)分別考察了虎杖總黃酮的超聲法和冷浸法提取提取工藝，比較兩種總黃酮提取的工藝可以看出，超聲法提取效果優(yōu)于冷浸法，并獲得虎杖總黃酮的最佳提取工藝為：乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)80%、料液比1∶50、超聲提取10 min.在該條件下，總黃酮提取率為19.31%.本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選的虎杖中總黃酮的提取工藝操作簡(jiǎn)單、提取率高，并為虎杖中總黃酮的后續(xù)開(kāi)發(fā)研究提供了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ).

［1］高學(xué)敏.中藥學(xué)［M］.北京：中國(guó)中醫(yī)藥出版社，2007.

GAO Xue－min.Chinese m edicine［M］.Beijing：China Press of Traditional Chinese Medicine，2007.（in Chinese）

［2］朱丹，袁芳，孟坤，等.黃酮類化合物的研究進(jìn)展［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2007，22（6）：387－388.

ZHU Dan，YUAN Fang，MENG Kun，et al.Research progress of flavonoids［J］.China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy，2007，22（6）：387－388.（in Chinese）

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Optim izing extraction technology of total flavonoids from Polygonum cuspidatum by orthogonal experiment

CHEN Lin－li1，2，F(xiàn)ANG Ji－de1，2，LI Li1，2
1.School of C hemical Engineering and Pharmacy，Wuhan Institute of Technology，Wuhan 430074，China；2.Key Laboratory for Green Chemical Process ofMinistry of Education，Wuhan Institute of Technology，Wuhan 430074，China

To compare the extraction rates between the ultrasonic method and the cold soak method of total flavonoids from Polygonum cuspidatum，the effects of ethanol concentration，solid-liquid ratio and extraction time on the extraction rateswere explored.And the technological parameters of the ultrasonic method and the cold soakmethod were optimized by orthogonal experiment.Using software spss 19.0，the data of the orthogonal experiment were analyzed.The results show that the effect of solid－liquid ratio on the extraction rates of total flavonoids from Polygonum cuspidatum is the biggest，followed by the ethanol concentration and the extraction time.The optimal extraction conditions are ethanol concentration of 80%，solid－liquid ratio of 1∶50 and ultrasonic extraction of 10 min.Under the condition，the extraction rate of total flavonoids is 19.31%.Compared with the cold soak method，the ultrasonic method has a higher extraction rate，which is helpful to the further development and use of total flavonoids in Polygonum cuspidatum.

Polygonum cuspidatum；total flavonoids；orthogonal experiment；ultrasonic method

TB35

A

10.3969/j.issn.1674-2869.2015.12.002

1674－2869（2015）12－0006－04

本文編輯：張瑞

2015－11－02

武漢工程大學(xué)研究生教育創(chuàng)新基金（CX2014022）

陳林莉（1991－），女，湖北黃岡人，碩士研究生.研究方向：中藥活性成分及制劑.*通信聯(lián)系人